第六部分放射性核素在生物和医学中的应用

放射性核素在生物和医学中的应用•第一节放射自显影技术•第二节放射免疫测定法•第三节放射性示踪技术•第四节放射性探针的合成•第五节分子杂交第一节放射自显影技术•放射自显影技术－是利用放射性核素衰变时发射的射线对乳胶的感光作用，在乳胶底片上现出影像，以显示标本或样品中的放射性物质的分布、定位和定量的方法。分子克隆９６５图放射自显影技术的优缺点：•1、能准确示踪定位。显示形态与功能的定位关系。•2、能在整体平面上同时比较，注入体内后的标记物质在各个脏器内的分布与代谢状态，分析在各脏器中的摄取量，在不同时期的吸收、分布、转运与排泄途径等动态关系。•3、是细胞内物质代谢研究的有力工具。•４、缺点是对某一位置上的放射性一般只能相对定量。用于放射自显影的感光材料（是由卤化银和明胶所组成的乳胶）•感光材料特点•卤素离子与银离子按一定规律、一定距离排列，形成一立方形的晶体点阵。•具有理想晶体结构的卤化银晶体对光线和核射线的作用不灵敏。•采用不同配方和制作工艺，使卤化银晶体出现晶体缺陷（不是完全规则的六面体立方结晶，而呈如三角形、圆形等）。•导致晶体内部的电荷不平衡。电荷不平衡之处对相反的电荷形成陷阱（亦称敏化中心）。陷阱对提高乳胶的灵敏度，起着重要的作用。•主要采用的感光材料有：•原子核乳胶：原子核乳胶是自显影中较理想的感光材料。它的银盐颗粒直径在0.2—0.5μm，密度大（1013银颗粒/平方厘米），分辨率高。主要用于微观放射自显影。•X光片：X光片两面都涂有保护层，防止乳胶层被划伤，其乳胶银颗粒较大，平均直径为2.5—3μm，密度较小（6×109银颗粒/立方厘米）。•氚片：氚片银粒的平均直径是1μm，单面没有保护层，因为保护层将吸收90%以上的发射的β粒子。其余性能与X光片类似。选择乳胶一般从敏感度和分辨率两方面来考虑。质量好的乳胶，颗粒细、密度大、敏感度低，则分辨力高。反之银盐的颗粒愈大，敏感度愈大，分辨力也愈差。剂量与曝光：放射性剂量给予的大小、曝光时间的长短与放射自显影乳胶底片影像效果好坏有很大关系。在一个实验中如何选取两者的大小，人们在实际实验中有很多经验。如：分不同的时间取片等。也有人推荐下面公式：设：L为单位面积上衰变的放射性强度Ａ０为单位时间上开始曝光时的放射性强度(μCi/cm2)Ａt为单位时间上终了曝光时的放射性强度(μCi/cm2)t为曝光时间,T为半衰期tAAL0则TeAAtt693.0,0因为LAATt00ln693.0所以乳胶感光原理（1）（2）（3）（4）（1）核射线与乳胶作用时，电离产生的电子；（2）电子向敏化中心移动，形成一阴电层；（3）银离子向阴电层聚集，与此同时银离子被还原成银原子；（4）银原子在敏化中心周围集中而形成潜影。这些潜影将在显影过程中起着重要地催化作用。因而也称为“显影中心”。注意：已经建立起来的潜影，在水、氧作用下会消退（这个现象的实质是溴化银晶体中所产生的极少量的银原子又退变成离子返回晶格），而失去原来的催化作用。所以在“曝光”期间应注意干燥、低温和隔氧。显影、停影和定影•显影和显影液（显影剂、促进剂、保护剂和抑制剂组成〕•停影和停影液•定影和定影液（定影液一般包括：定影剂、保护剂、停显剂和坚膜剂）•水洗和干燥Х光胶片显影液配方水（50℃）（ml）800米图尔（g）2.2无水亚硫酸钠（g）72海得尔（g）8.8无水碳酸钠（g）48溴化钾（g）4加水至总量（ml）1000常用停影液配方是：２８％醋酸４８ｍｌ，加水至１０００ｍｌ。酸性坚膜定影液的配方溶液一①海波（硫代硫酸钠）240g②蒸馏水（５０℃）500ml溶液二①蒸馏水（５０℃）150ml②无水亚硫酸钠15g③２８％醋酸（冰醋酸３份，加水８份）48ml④钾明矾15g加水总量至：1000ml按上面试剂的顺序分别配置溶液一、二，然后把溶液二加到溶液一中，并剧烈搅拌。自显影的阅读与相对定量•（1）光密度法（根据自显影中影像的黑化程度来确定组织中放射性核素相对量的方法）•同时制备一套已知放射性强度标准样品和待测样品在完全相同的情况下进行放射自显影。用光密度计测量出标准和待测样品的黑化强度，再比较定出相对含量。•（２）颗粒数量计算法（也称：微尺目数法）•它是利用目镜微尺在显微镜视野下圈定一定范围（如50平方微米），进行射线颗粒数量计数。推算出单位面积或细胞、细胞核的相对标记强度。•（３）径迹数量计算法•这是计算由射线粒子在胶片上所形成的径迹的数量来测定组织和细胞中放射性核素相对含量的方法。计数方法与上述的颗粒计数法相同。求出单位面积内的径迹数。第二节放射免疫测定法•这是一种超微量分析技术，具有灵敏度高和特异性强的突出优点。•这类方法名称繁多，常见的名称有：放射免疫测定法、免疫放射测定法、竞争性蛋白质结合测定法、放射受体测定法、放射酶测定法、体外放射分析法等。•此方法的建立和发展，给医学生物学的一个重要分支—内分泌学带来了革命。•本方法的创始人荣获了1977年诺贝尔生理学和医学奖。基本原理•利用放射性标记抗原(Ag*)、待测抗原(Ag)与特异性的抗体(Ab)竞争结合。•在一个放免实验里(Ag*)和(Ab)的量需保持恒定，Ag与Ag*之和大于Ab上有效结合位点数目。•此时，Ag与Ag*-Ag间存在着函数关系AgAgAg*AbAgAg*Ag抗原抗体BFB/FB/B+F4/2=24/6=67%оо3/3=13/6=50%оооооооооо2/4=0.52/6=33%ооооооооооооооооооооооооооооооооо1/5=0.21/6=17%游离的Ag*结合的Ag*-Ag-2024681012141618200.10.20.30.40.50.60.7B%ContentofStandardantigen标准竞争抑制曲线基本步骤：•放射免疫分析目的：检测待测样品中抗原（Ag）的量。•如上图加样。０－１是标准样品；Ｔ管；ＮＳＢ是非特异性管；待测管可是若干个待测样品。•室温放置或保温一定时间。•加入二抗（Ｔ管不加〕，室温放置或保温，使二抗与抗原-抗体复合物充分结合成分子量很大的复合物；•3500-5000转/分离心（T管不离心），去上清（抗原抗体的复合物沉淀，）；•探测器测cpm值。利用公式计算B%：标准管0123456Ag*1ul1ul1ul1ul1ul1ul1ulAg010204080160200Ab1111111待测管1ul?血清1ＴNSB1ul1ul04000）本底（）（）ＮＳＢ（标准管cpmdpmTcpmcpmB)(%×１００％以已知的标准抗原含量（ng/ml）为横坐标，B%为纵坐标做标准曲线。-2024681012141618200.10.20.30.40.50.60.7B%ContentofStandardantigen标准竞争抑制曲线待测样品的测量，先与标准样品一样，计算出B%，再在标准曲线上查出待测样品的抗原含量。•对于抗原、抗体的制备，刘兢老师的免疫学课中会做介绍。•在这不作介绍了。第三节放射性示踪技术•示踪－即为在研究对象中引入一标记物作为探针，通过观察探针的去向，了解其分布、运动及转化的情况。•放射性示踪的基本依据是：（1）可测性，因为放射性核素总是自发发射各种射线。（2）放射性核素与其同种非放射性核素理化性质基本相同，一般生物体不区别对待它们。•放射性示踪的特点：灵敏度高、操作简便、合乎生理条件、可解决其他方法不能解决的难题、准确定位。标记化合物来源少、技术操作要求高、轻元素的同位素效应、放射效应。例：柠檬酸HO—C—COOHH2C—C*OOHH2C—COOH酶2HC—C*OOHH—C—HH2C—COOHOα—酮戊二酸KMnO4C—OHH2C—COOHH—C—HO+C*O2＋ＣＯ２＋Ｈ２Ｏ琥珀酸柠檬酸脱羧机制的确定示踪实验的设计及步骤：•1、根据实验目的和实验周期长短，选择合适的放射性核素及其标记化合物。•(1)合适放射性核素的选择,•(2)合适标记化合物的选择：•2、示踪剂的用量，根据实验周期长短，示踪剂的给予方式的不同（如：喂养、静脉注射、呼吸等）,被示踪生物对示踪剂的利用率和在体内分布及排泄情况，确定。•3、选择合适的辐射防护条件和废物处理方法,对于操作复杂的实验，需先做空白实验。•4、根据实验的要求及示踪剂射线类型，选择合适的样品测量方法。•（包括：定量测量、定位测量、定性测量〕•5、对放射性测量结果进行数据处理，并根据实验要求计算、书写出一定的数据形式。放射性核素稀释分析法（放射性核素稀释法又称为载体法或俘获技术）。此分析法的特点：可以对含有多种性质相近成分的混合物中某一化合物进行定量分析。•正稀释法：分析计算混合物中某一化合物的含量（ＷＸ）。•具体方法如下：（1）在混合物中加入一定量（Ｗ０）的已知放射性比活度（Ｓ０）的与待测化合物相同的放射性核素或标记化合物；（2）充分均匀混合；（3）分离纯化待测化合物，直至恒定比活度（Ｓ）；•根据放射性被加入混合物前后，虽比活度发生了变化，但放射性总强度没变，可由下列方程式成立。•反稀释法：分析计算混合物中某一放射性标记化合物的含量（ＷＸ）。•具体方法如下：（1）取一定量的待测混合物进行分离纯化，直至恒定放射性比活度，探测器测得该活度为Ｓ０；（2）在混合物中加入大量的与待测标记化合物相同的非标记化合物，已知加入量为Ｗ０；（3）充分混合，并分离纯化，直至恒定放射性比活度，探测器测得该活度为Ｓ；•同理，有下列方程成立。SWWSWx000100SSWWxxxWWSWS0000WSSSWx放射性探针的制备•双链探针的合成法:•单链探针的合成法:切口平移法用随机寡核苷酸引物合成均一标记的DNA探针合成可与克隆于噬菌体或M13噬菌体载体上的序列互补的放射性标记DNA。将克隆于特定载体上的靶序列转录成放射性的RNA，在此载体上带有可被噬菌体依赖于DNA的RNA聚合酶识别的sp6启动子。切口平移法•混合下列成分:10×切口平移缓冲液2.5ul；ＤＮＡ模板0.5ug；未标记的三种20nmol/L的dNTP各１ul；一种α－３２Ｐ－dNTP１ul；加水至终体积为21.5ul，使混合液骤冷至０Ｃ。•加入2.5ul胰ＤＮＡ酶Ⅰ(10mg/ml，用1×切口平移缓冲液配制〕，振荡均匀。•加入E.coilDNA聚合酶2.5单位•16℃温育60min•加入25ul100mmol/LEDTA终止反应。•将反应混合物上柱（SephadexG50)，用ＴＥ缓冲液洗脱，分管收集，测cpm值，合并第一个cpm峰（探针〕，第二个cpm峰为α－３２Ｐ－dNTP。•标记水平的计算：32P-dNTP利用率＝*DNA(dpm/g)=DNA重量第一个峰总计数(cpm)－本底探测器的探测效率第一个峰总计数－本底(cpm)第一,第二峰总计数（cpm)×100%3，OH缺口（胰DNA酶I作用）缺口向3，端移动大肠杆菌DNA聚合酶I5，-3，聚合酶活性用随机寡核苷酸引物合成均一标记的DNA探针•首先需要纯化所需制备探针的目的DNA（200ug）并与过量的随机引物（75ug）混合•将混合液没入沸水中煮3min。•到时取出后，迅速没入冰水中1min。•取出，并移入已配置好的（如下）混合液中。（20mmol/LDTT1ul;dGTP,dCTP,dTTP的混合液，浓度各5mmol/L1ul;10×RP缓冲液0.67ul;α-32P-dATP（比活度3000Ci/mmol）3ul;H2O1ul)•加5各单位（约1ul）的大肠杆菌聚合酶IKlenow片段，混合•室温下温育至少3小时。•在反应液中加入10ulA缓冲液。随机引物可由以下三种途径得到：1、用DNA酶I消化小牛胸腺DNA或鲑精DNA产生大量长为6—12核苷酸的单链DNA。2、直接从一些厂家购买用小牛胸腺DNA制备的随机引物。3、在自动DNA合成仪上合成，这种合成引物也可在公司买到。单链探针的制备•由D