第十三章DNA的复制和修复

１第十三章DNA的复制和修复生物体的遗传信息储存在DNA中，并通过DNA的复制由亲代传给子代。在子代的生长发育中遗传信息自DNA转录给RNA，然后翻译成蛋白质以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。1958年，F.Crick提出中心法则：（1）以原DNA分子为模板，合成出相同DNA分子的过程。（2）以某一段DNA分子为模板，合成出与其序列对应的RNA分子的过程。（3）以mRNA为模板，根据三联密码规则，合成对应蛋白质的过程。中心法则揭示了生物体内遗传信息的传递方向。图DNA生物合成有两种方式：DNA复制和反转录DNA体内复制涉及：原核、真核生物的染色体、细菌质粒（环状，双链）、真核细胞器DNA（线粒体、叶绿体）、病毒（双链，环状）DNA的体外复制：分子克隆。DNA的复制DNA半保留复制1953年，Watson和Crick在提出DNA双螺旋结构模型时就推测DNA可能按照半保留机制进行自我复制。P321图191Watson和Crick提出的DNA双螺旋复制模型在复制过程中，首先亲代双链解开，然后每条链作为模板，在其上合成互补的子代链，结果新形成的两个子代DNA与亲代DNA分子的碱基顺序完全一样，而且每个子代DNA分子中有一条链完全来自亲代DNA，另一条是新合成的。1958年，Meselson和Stahl用15N标记E.coli.DNA，证明了DNA的复制是半保留复制。P322图19-2DNA的半保留复制。1963年，Cairns用放射自显影法，在显微镜下２首次观察到完整的正在复制的E.coli.染色体DNA。P323图19-33H-脱氧胸苷标记E.coli.DNA，经过将近两代时间，用溶菌酶消化细胞壁，将E.coli.DNA转至膜上，干燥，压感光胶片，3H放出β粒子，还原银，在光学显微镜下观察。用这种方法证明了大肠杆菌染色体DNA是一个环状分子，并以半保留的形式进行复制。DNA的半保留复制可以说明DNA在代谢上的稳定性。经过多代复制，DNA的多核苷酸链仍可以保持完整，并存在于后代而不被分解掉。复制起点、单位和方向DNA的复制是在起始阶段进行控制的，一旦复制起始，它就会继续下去直到整个复制子完成复制。复制起点复制起点是以一条链为模板起始DNA合成的一段序列。有时，两条链的复制起点并不总是在同一点上（如D环复制）。在一个完整的细胞周期中，每一个复制起点只使用一次，完成一次复制过程。多数生物的复制起点，都是DNA呼吸作用强烈（甲醛变性实验）的区段，即经常开放的区段，富含A.T。★环状DNA复制起点的确定方法P325图19-6★复制起点的克隆和功能分析——重组质粒转化法大肠杆菌的复制起点oriC区1Kb的重组质粒在转化子中的复制行为与其染色体一样，受到严密控制，每个细胞只有1-2个拷贝，用核酸外切酶缩短oriC克隆片段的大小，最后得到245bp的基本功能区，携带它的质粒依然能够自我复制，拷贝数可以增加到20以上，这说明发动复制的序列在245bp的基本功能区，而决定拷贝数的序列在基本功能区之外和1Kb之间。鼠伤寒沙门氏菌的起点位于一段296bp的DNA片段上，与大肠杆菌的复制起始区有86%同源性，３而且有些亲缘关系较远的细菌，其复制起点在大肠杆菌中亦能起作用。因此，复制起始区的结构可能是很保守的。起始序列含有一系列对称的反向重复和某些短的成簇的保守序列。复制单位复制子(Replicon)：Genome能独立进行复制的单位，每个复制子都含有一个复制起点。原核生物的染色体和质粒、真核生物的细胞器DNA都是环状双链分子，它们都是单复制子，都在一个固定的起点开始复制，复制方向大多数是双向的，少数是单向复制。多数是对称复制，少数是不对称复制（一条链复制后才进行另一条链的复制）。环状DNA的复制眼象θ，称θ形复制。真核生物的染色体DNA是线形双链分子，含有许多复制起点，因此是多复制子，每个复制子约有100-200Kbp。人体细胞平均每个染色体含有1000个复制子。病毒DNA多种多样，环状或线形，双链或单链，但都是单复制子。复制方向定点起始，复制方向大多数是双向的（等速进行或异速进行），形成两个复制叉，少数是单向复制，形成一个复制叉。★用放射自显影实验判断DNA的复制方向及速度低放射性3H-脱氧胸苷高放射性3H-脱氧胸苷a.单向b.双向等速三种结果图形c.双向异速E.coli.的一个温度敏感株，在42℃时，能使DNA在完成复制后，不再开始新的复制过程，而在25℃时复制功又能能恢复。DNA的几种复制方式直线双向复制单点，双向，T7多点，双向，真核染色体DNAθ型复制：环状双链DNA，单向或双向（E.coli.）４滚环复制：环状单链DNA，Φx174D环复制：线粒体、叶绿体DNA多复制叉复制：第一轮复制尚未完成，复制起点就开始第二轮的复制。在E.coli.富营养时，可采取多复制叉复制方式。E.coli.DNA的复制最快可达50Kb/min，完全复制需40min，富营养时，20min分裂。而真核染色体要6-8小时。与DNA复制有关的酶及蛋白质因子目前已发现30多种酶及蛋白质因子参与DNA复制DNA的聚合反应和聚合酶DNA生物合成5，→3，，化学合成3，→5，DNA聚合反应必备的条件⑴DNA聚合酶⑵DNA模板(反转录时用RNA模板)⑶引物(DNA、RNA或蛋白质)⑷4种dNTP⑸Mg2+聚合反应过程及特点总反应式：n1dATPDNApol.dAMPn2dGTP+DNAdGMPDNA+（n1+n2+n3+n4）PPin3dCTPMg2+dCMPn4dTTPdTMPP329图19-10P330图19-11在链的延长过程中，链的游离3，-羟基，对进入的脱氧核糖核苷三磷酸α磷原子发生亲核攻击，生成3，.5，-磷酸二酯键，并脱下焦磷酸。DNA聚合酶的反应特点：⑴以4种dNTP为底物⑵反应需要接受模板的指导，不能催化游离的dNTP的聚合。⑶反应需有引物3，-羟基存在⑷链生长方向5，→3，⑸产物DNA的性质与模板相同５由DNA聚合酶催化的几种DNA聚合类型P331图19-12发荚环结构：加入单链DNA作为模板和引物，3＇羟基端回折成引物链。末端延伸聚合：加入双链DNA作为模板和引物，3’末端突出作为模板。分枝型和切口平移型聚合：加入双链DNA，聚合发生在切口或末端单链区。环形聚合：加入带引物的环形DNA作为模板。E.coliDNA聚合酶E.coli.DNApol.I（Kornberg酶，400copy/cell）单体酶，分子量109Kd，含一个Zn2+，每个细胞中含400个DNApol.Ⅰ催化活性：5，→3，聚合活性3，→5，外切活性5，→3，外切活性用蛋白水解酶将DNApol.Ⅰ部分水解可得：大片段（Klenow），75Kd，活性：5，→3，聚合活性、3，→5，外切活性。小片段，36Kd，活性：5，→3，外切活性（只作用于双链DNA的碱基配对部分，切除修复）。Klenow片段的用途：a补齐DNA3，隐缩未端b.标记DNA片段未端c．cDNA合成第二链d．dDNA测序E.coli.DNAPol.Ⅱ（100copy/cell）单体酶，分子量120Kd催化活性：5，→3，聚合(活性很低)3，→5，外切可能在DNA的修复中起某中作用。E.coli.DNApol.Ⅲ（复制酶，10-20copy/cell）寡聚酶，全酶由10种共22个亚基组成，α、ε和θ三种亚基组成核心酶。P334表10-3DNApol.Ⅲ是合成新链DNA主要的酶，又称复制酶(Replicase)Pol.Ⅲ的5，→3，外切酶活性只作用于单链６DNA。P334表19-2E.coli三种DNA聚合酶的性质比较★DNA聚合酶有6个结合位点⑴模板DNA结合位点⑵引物结合位点⑶引物3，-OH位点、反应位点⑷底物dNTP结合位点⑸5，→3，外切位点(pol.Ⅱ没有)⑹3，→5，外切位点(校正)真核生物DNA聚合酶P334表19-4真核生物DNA聚合酶真核DNA聚合酶一般不具备外切活力，可能由另外的酶在DNA复制中起校正功能。⑴DNA聚合酶α，多亚基，功能与E.coli.pol.Ⅲ类似，是真核DNA复制酶。⑵DNA聚合酶β，主要在DNA损伤的修复中起作用。⑶DNA聚合酶γ，从线粒体得到，可能与线粒体DNA的复制有关。⑷DNA聚合酶δ，特点：有3，→5，外切活力。引物酶或RNA聚合酶（引发酶）细胞内，DNA的复制需要引物（DNA或RNA），引物酶或RNA聚合酶可合成6-10个碱基的RNA引物。★DNA复制为什么要用RNA引物？（为什么DNA聚合酶要用引物，RNA聚合酶不需要引物？）P338⑴从模板复制最初几个核酸时，碱基堆集力和氢键都较弱，易发生错配⑵新复制的最初几个核苷酸，没有与模板形成稳定双链，DNA聚合酶的5，→3，校对功能难发挥作用。解螺旋酶大肠杆菌的解螺旋酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ与rep蛋白共７同作用，将DNA两条链解开。解螺旋酶I、II、III沿着模板链的5’→3’方向随着复制叉的前进而移动，而rep蛋白则在另一条模板链上沿3’→5’方向移动。DNA旋转酶属DNA拓扑异构酶Ⅱ，可引入负超螺旋，消除复制叉前进时带来的扭曲张力。拓扑异构酶分两类：I和II，广泛存在于原核生物和真核生物。拓扑异构酶I使DNA的一条链发生断裂和再连接，反应无须供给能量，主要集中在活性转录区，与转录有关。拓扑异构酶Ⅱ使DNA的两条链同时断裂和再连接，当它引入超螺旋时需要由ATP供给能量。分布在染色质骨架蛋白和核基质部，与复制有关。单链DNA结合蛋白（SSB）复制叉上的解螺旋酶，沿双链DNA前进，产生单链区，大量的单链DNA结合蛋白与单链区结合，阻止复性和保护单链DNA不被核酸酶降解。DNA连接酶（ligase）连接双链DNA上的切口。大肠杆菌连接酶只能在模板上连接DNA缺口。T4DNAligase即可连接粘性末端的DNA，又可连接平齐末端的双链DNA。E.coli.和其它细菌的DNAligase以NAD为能源，动物细胞和噬菌体DNAligase以ATP为能源。DNA复制的拓扑结构P338-339DNA的半不连续复制P336图19-15DNA的半不连续复制DNA聚合酶催化的方向是5，→3，。前导链：滞后链：1968年，发现冈崎片段。长度：细菌：1Kb-2Kb，相当于一个顺反子的大小。真核：100-200bp，约等于一个核小体DNA的长度。DNA复制过程（E.coli.）P342图19-17大肠杆菌的复制体结构示意８图复制的起始引发：当DNA的双螺旋解开后，合成RNA引物的过程。引发体：引物合成酶与各种蛋白质因子（dnaB、dnaC、n、n＇n＇＇I）构成的复合体，负责RNA引物的合成。引发体沿着模板链5’→3’方向移动（与冈崎片段合成的方向正好相反，而与复制叉移动的方向相同），移到一定位置上即可引发RNA引物的合成。E.coli.DNA复制原点oriC，由245bp组成，三组13bp重复序列（近5，端处），四组9bp重复序列（另一端处）。图大肠杆菌复制原点起始复制所需蛋白质：DNaA在原点处打开双螺旋DNaB使DNA解旋DNaCDNaB结合在原点所需Hu刺激起始引物酶（DNaG）合成RNA引物SSB结合单链DNARNA聚合酶促进DNaA活性旋转酶松驰DNA扭曲应力20个DnaA结合在四组9bp重复区，形成起始复合物，DNA环绕此复合物。三组13bp重复区依次变性，产生开放型复合物。DnaB（在DnaC协助下）与开放复合物结合，进一步解链。DNA链的延长反应前导链只需要一个RNA引物，后随链的每一个冈崎片段都需要一个RNA引物，链的延长反应由DNApol.Ⅲ催化。复制体：在DNA合成的生长点（既复制叉上）分布着许多与复制有关的酶和辅助因子，它们在DNA的模板链形成离散的复合物，彼此配合进行高度精确的复制，称为复制体。９复制体沿着复制叉方向前进就合成DNA。RNA引物的切除及缺口补齐DNApolⅠ的5，→3，外切活力，切除RNA引物。DNApolⅠ的5，→3，合成活性补齐缺口。DNA切口的连接DNAligase，动物、真核由ATP供能，