电镜技术四.

第八章扫描电镜的生物样品制备技术一、SEM生物样品制备的基本要求生物样品与金属、矿物等材料不同，它具有质地柔软、容易变形、导电性能差、二次电子发射率低以及含水量多(有的含水可达80％以上)等特点。因此，在对于高真空状态下的生物样品做扫描电镜观察时，必须严格地遵循一定的原则和操作程序，对样品进行必要的处理。针对生物样品的特殊性，在进行SEM样品制备时，一般应掌握以下原则：(一)每一操作过程，都应注意防止对样品的污染和损伤，使被观察的样品尽可能地保持原有的外貌及微细结构。(二)去除样品内水份，以利于维持SEM的真空度和防止对镜筒的污染。但在脱水和干燥处理时，要尽量减少和避免样品体积变小及收缩变形等人工损伤。(三)降低样品表面的电阻率，增加样品的导电性能，以提高二次电子发射率，建立适当的反差和减少样品的充放电效应。(四)无论观察组织细胞的表面或内部微细构造，都应注意确认和保护样品的观察面。二、SEM生物样品制备的基本操作程序在SEM生物样品制备过程中，除比较坚硬的组织(如骨骼、牙齿、指甲、毛发，贝壳、昆虫及某些植物样品)和需要采用某些特殊制备技术者(如管道铸型扫描、低电压观察法等)以外，一般生物组织均需要经过取材、清洗、固定、脱水、干燥及金属镀膜等基本程序处理以后，才能进行SEM观察(一)取材SEM样品的取材，与透射电镜的超薄切片法一样，是整个样品制备过程中的关键步骤之一。其主要要求有以下几点：1.取材前应作好药品及器材准备。每次取材的品种及数量不宜过多，以免延误时间、影响制样效果。2.取材部位要准确，取样大小要适当。以观察组织细胞表面结构为主的样品可以大一些，其直径最大不宜超过5mm，高度可在3～5mm之间。以观察组织细胞内部结构为主的样品，其直径应小于2mm，高度可在3mm左右。为了提高固定，脱水、干燥及镀膜效果，在满足所需要观察内容的条件下，样品块以尽量小一些为宜。3.为了使被观察的样品更近于活体状态，材料应尽量新鲜。取材用的刀片要锋利，操作要轻巧敏捷，严防对样品的挤压损伤，同时应作好对样品观察面的标记。(二)样品的清洗SEM观察，对样品表面的清洁要求十分严格，在样品制备过程中，应始终注意清除覆盖于样品表面的粘液、分泌物、组织液、血液、细胞碎片及药物反应沉淀物等所造成的污染，否则不仅会掩盖样品表面的微细结构，甚至会得出错误的结果和判断。1.清洗液的选择清洗时应根据不同的样品和要求，选用适当的清洗液：(1)对于贴附于一般组织表面的血液、粘液和其他分泌物，可选用等渗的生理盐水、5％碳酸钠溶液或与固定液相应的缓冲液进行冲洗。(2)游离细胞如精子、血细胞等，以及处于悬浮液中的微生物、寄生虫等细小的样品，可选用缓冲液或等渗溶液进行清洗。(3)组织培养细胞的清洗，一般选用相应的组织培养液为宜。(4)某些特殊样品则需针对性地选用一些特殊的清洗液，才能取得满意的清洗效果。(5)一般样品固定后的清洗，大都选用相应的缓冲液，但在制样过程中，每更换一次试剂，为了消除可能出现于样品表面的反应沉淀物，均需用双重蒸馏水进行充分清洗。2、清洗的方法(1)比较干净的组织可在固定后清洗，其具体方法是：将样品放入干燥的玻璃小瓶内，倒入足够量的清洗液(最少为样品体积的20倍)，按一定方向轻轻摇动小瓶，并反复更换新清洗液，以达到充分清洗的目的。(2）表面覆盖大量粘液和杂质的样品，宜在固定前清洗。为了提高清洗速度和效果，对一些粘着杂质多而紧密的样品，可利用振荡器进行清洗或用注射器(或喷射瓶)加压冲洗。清洗所用的时间，可根据样品附着物的情况而定。(3)游离细胞、微生物及其他微小生物样品的清洗，一般采用离心清洗法。(4)超声清洗法适用于表面形态结构复杂、皱折凹陷多而又嵌有细小杂质，不易清洗的样品。(5)灌流清洗法为了避免取材后血液对组织结构的污染，特别是在以组织细胞内部结构为主要观察对像时，经常采用一种先灌流清洗再取材的所谓灌流清洗法。3.清洗时的注意事项(1)在选择清洗液时，要使其氢离子浓度(pH值)、渗透压及清洗液的温度，尽量符合组织细胞处于活体状态时的生理条件，以免引起样品的收缩或膨胀变形及其他人工损伤性变化。(2)往容器内添加和更换清洗液时，应沿瓶壁缓缓滴加，移动样品时，要采用牙签贴附法，以避免强力冲击和夹持样品可能出现的损伤。需用喷射、超声或作用较强的溶剂清洗样品时，要严格控制强度和时间，密切观察样品的变化。(3)在清洗换液过程中，应把时间安排紧凑，使样品始终保持湿润，严防发生空气干燥，造成标本的皱缩塌陷。与透射电镜一样，为了把生物样品的微细结构和外部形貌真实的保留下来，对样品必须进行固定处理，对软体的组织尤为重要．另外，通过固定还可以使组织硬化，大大增强样品在下一步干燥过程中耐受表面张力变化等物理作用的能力；同时，固定作用还能提高样品对镜筒内高真空和电子束轰击的耐受力．1.常用的固定剂与透射电镜法基本相同，主要包括醛类(戊二醛glutaraldehyde多聚甲醛paraldehyde)和四氧化饿(锇酸osmiumtetroxide，OsO4)。(三)样品的固定(1)戊二醛一般配制浓度为1～4％，常用浓度为2.5％(pH7.2～7.4)。戊二醛固定剂特点是穿透力比较强，性能比较稳定，可凝固组织细胞中的蛋白成分，有利于组织坚硬，适用于较大的生物样品及器官灌流固定，应用普遍。醛类固定剂的缺点是不能增加样品的二次电子发射率，而对某些标本的穿透固定作用比较缓慢。(2)四氧化锇一般配制浓度为0.5～2％，常用浓度为0.5～1.0％(pH7.2～7.4)。四氧化锇对糖元以外的所有细胞成分几乎都有凝固作用，是进行超微结构研究的理想固定剂之一。四氧化锇属重金属盐类，其锇分子可以保留在固定后的细胞结构成分上，具有增加电子反差(电子染色)作用，所以可提高样品的二次电子发射率和减少样品的充放电效应。其缺点是易氧化，价格昂贵，而且其蒸气对操作者的粘膜也有一定固定损伤作用。(3)其它固定剂甲醛(福尔马林)、多聚甲醛、高锰酸钾(KMnO4)等亦可作为SEM样品的固定剂，但使用较少。2．固定的温度及时间有人主张SEM样品固定可在37℃或室温内进行，但一般仍以在4℃条件下完成固定过程较为适宜。至于固定所需时间，则可因具体情况而异；当戊二醛或四氧化锇作为单独使用的固定剂时(单固定法)，戊二醛固定所需时间，对一般软组织为1～3小时或稍长，对培养细胞和游离细胞可缩短为30分钟左右，四氧化饿的固定时间，一般在30～60分钟之间即可。不过为了提高固定效果，目前大都主张采用“戊二醛——锇酸”双重固定法。即首先用戊二醛固定1～3小时，经缓冲液充分清洗后,再用四氧化饿固定30～60分钟。3．固定时的注意事项(1)固定时放置样品的玻璃容器必须经过净化和干燥处理，以防止污染或产生其他化学反应。(2)固定剂的液体量要充分，每一容器内所固定的样品数量要少，固定期间要间断轻晃容器，以保证样品得到充分固定。(3)固定液配制后需存入4℃冰箱内，但最好不要久存，使用前应测其pH值，使其符合固定要求。若固定液偏酸，则会降低固定效果并可导致细胞出现损伤性变化。(四)脱水由于SEM样品块比透射电镜样品块要大的多，所以SEM样品的脱水处理，对于保证金属镀膜装置和SEM镜筒的真空度，防止样品在高真空状态下的损伤变形等方面，都有着重要意义。SEM样品所选用的脱水剂和脱水操作程序，与透射电镜样品基本相同，即用不同浓度的乙醇或丙酮，采取所谓“梯度脱水法”逐步取代样品中的水分。脱水剂的浓度由低至高，依次为30％、50％、70％、80％、90％、100％(二次)。样品在每一级浓度停留时间为15～30分钟。如果样品块较小，则脱水时间相应缩短；若样品为单层细胞，其每步脱水时间可缩为3～5分钟。在脱水过程中，亦应防止样品暴露于空气中，发生干燥变形等问题。(五)样品的干燥处理尽管SEM生物样品经脱水后，所含水分可被脱水剂取代，但在样品内却含有脱水溶剂甚至残留少量水分，仍不符合SEM高真空条件的要求，特别是样品表面溶剂及残留水分所形成的表面张力，在高真空状态下会导致表面结构的严重破坏，所以经脱水后的样品，仍需进一步干燥处理，此为SEM样品制备的成败关键。一般常用的样品干燥法，主要有以下几种：1．空气干燥法(自然干燥法)这是一种最简便而比较原始的干燥法，将经过常规固定的样品，放入低表面张力的液体(如乙醇、丙酮、乙醚、环氧丙烷、氧化丙烯等)内，采用梯度法置换出样品中的水分，然后再把样品放在空气中让样品所含溶剂自然挥发。由于这些溶剂具有低表面张力的特点，因此在挥发过程中既不致过分的收缩及损伤样品，又能达到干燥的目的。不过与其它干燥法相比，自然干燥法仍会使许多样品发生变形收缩，故本法只适用于比较坚硬、或具有鳞片及含水分较少的生物样品。2．真空干燥法本法系将经过固定脱水的样品，直接放入真空镀膜仪内，在低真空状态下使样品内的溶液逐渐挥发，当达到高真空时样品即可干燥；接着便对样品进行金属镀膜，最后送SEM观察。尽管本法简单易行，但由于在真空干燥过程中，样品表面仍受到一定的表面张力影响，因而仍难于避免一定程度的人为假象。现在只是在缺少其它先进干燥手段时，才考虑选用。3．冷冻干燥法是将未处理的新鲜样品或仅作固定及脱水处理的标本，迅速投入液氮或其它骤冷剂(氟利昂12、氟利昂22等)中，使样品快速冷冻，而后将样品移入真空镀膜仪内，让样品中已结为冰的“水分”及其溶剂，在高真空状态下升华，样品亦随之得到干燥。由于在升华过程中，组织内液体由固态直接转为气态，因此不存在气相与液相之间的表面张力问题，故对样品损伤较小。但冷冻干燥法存在着费时间(有时达数小时或几十小时)、需要特殊的低温条件、易出现冰晶损伤等缺点，因而影响了推广应用。当代在SEM设计时，有的仪器已装有样品冷冻装置，可在电镜内完成冷冻、干燥、金属镀膜等处理程序，给操作人员带来很大的方便，而且样品损伤也小。4．临界点干燥法(criticalpointdryingmethod，简称CPD法)这是目前认为既可靠而又理想的样品干燥法。国内外均有定型商品仪器(临界点干燥器)出售，已被广泛推广使用。(1)简明工作原理空气干燥法中提出，为防止脱水液挥发时，样品因表面张力的变化而收缩，需要使用表面张力低的溶剂脱水。用临界点干燥器可以基本上消除表面张力的影响。众所周知，温度升高使液体变成气体，容积增大挥发出去。但在密闭的容器中，气体不能溢出而压力增大；气体与液体混在；气体密度可增大到和液体一样；气相与液相的界面消失；液体的表面张力将不复存在。这种气液难分的状态就称为临界状态。此时的温度和压力即临界温度和临界压力。适时打开密闭的容器排出气体，这会比空气干燥时的逐渐挥发要快得多，特别是不再受表面张力的影响，这样就消减了使样品收缩的危害。(2)媒介液与中间液的选择一般将临界干燥器内起临界干燥作用的液体称媒介液或过渡液，它的选择条件是临界温度及压力较低、价格便宜、而且保存方便。液态CO2的临界温度为31.5℃，临界压力为72.8个大气压，与其它媒介液相比更符合选择条件，因此液态CO2在临界点干燥时，已被普遍使用。在上述临界点干燥之前的样品，虽然已经脱水处理，但样品内含有乙醇或丙酮，由于这两种溶剂与C02的互溶性很差，在干燥过程中不易被CO2替换出来。所以在干燥处理以前，必须先用一种与CO2互溶性好的中间液，以取代样品中的乙醇或丙酮。当前一般都选用醋酸异戊酯作为中间液，只要将样品置入此液内约15—30分钟，即可达到从样品内全部替换出乙醇或丙酮的目的。由于醋酸异戊酯与液体CO2极易互溶，所以在随后进行的临界点干燥效果极为理想。（3）临界点干燥的操作程序①样品预处理；包括取材、固定、脱水、中间液置换(醋酸异戊酯15～30分钟)。②放置样品：把经过处理的样品放入不锈钢样品篮内，而后将此篮放进临界点干燥器高压样品室，并旋紧室盖。③注入液体CO2：打开干燥器进气阀门，使CO2进入样品室约占70～80％空间，然后关闭贮液钢瓶和进气阀门。④CO2置换：将样品室