疟疾诊断标准及处理原则【GB_

【GB15989—1995】疟疾诊断标准及处理原则根据《中华人民共和国传染病防治法》及《中华人民共和国传染病防治法实施办法》制订本标准。1主题内容与适用范围本标准规定了疟疾的诊断标准及处理原则。本标准适用于各级各类防疫和医疗卫生机构对疟疾的诊断和处理。2诊断原则根据疟区住宿史，发病时有定期发冷、发热、出汗等临床症状，脾肿大等体征，以及病原学检查、血清免疫学检查等结果，予以诊断。3诊断标准3.1曾于疟疾传播季节在疟疾流行区住宿，或有输血史。3.2间歇性定时发作，每天、隔天或隔两天发作一次。发作时有发冷、发热、出汗等临床症状。发作多次可出现脾肿大和贫血。重症病例出现昏迷等症状(详见附录C)。3.3用抗疟药作假定性治疗，3天内症状得到控制者。3.4间接荧光抗体试验或酶联免疫吸附试验抗体阳性(详见附录B)。3.5血涂片查见疟原虫。其种类有间日疟原虫、恶性疟原虫，三日疟原虫和卵形疟原虫(详见附录A)。疑似病例：具备3.1与3.2。临床诊断：疑似病例加3.3或3.4。确诊病例：疑似病例加3.5。按查见的疟原虫种类，分为间日疟、恶性疟、三日疟和卵形疟。4处理4.1治疗4.1.1间日疟、三日疟和卵形疟治疗成人量氯喹1.2～1.5g3日分服(第1日0.6g，第2、3日各0.3或0.45g)，加伯氨喹90～180mg4～8日分服(每日22.5mg)。4.1.2恶性疟治疗4.1.2.1对氯喹未产生抗性地区恶性疟治疗成人量氯喹1.2～1.5g3日分服(第1日0.6g，第2、3日各0.3或0.45g)，加伯氨喹67.5mg3日分服(每日22.5mg)。4.1.2.2对氯喹产生抗性地区恶性疟治疗任选以下方案之一：哌喹1.5g3日分服，加伯氨喹45或67.5mg2日或3日分服；咯萘啶1.2g加磺胺多辛1.0g2日分服，加伯氨喹45或67.5mg2日或3日分服；咯萘啶0.8～1.0g加磺胺多辛1.0～1.5g加乙胺嘧啶50～75mg，均2日分服；青蒿琥酯钠600mg5日分服(第1日100mg×2次，第2～5日每日50mg×2次)，加伯氨喹67.5mg3日分服(以上均为成人量)。4.1.3疑似病例假定性治疗成人量氯喹0.6g顿服，在氯喹抗性地区用哌喹0.6g顿服。确诊后按4.1.1或4.1.2治疗。4.1.4间日疟抗复发治疗流行季节前，对1或2年内有疟史者，成人用乙胺嘧啶100mg2日分服，加伯氨喹90mg4日分服。4.1.5重症病例治疗(洋见附录C)4.1.5.1用青蒿琥酯钠或咯萘啶或蒿甲醚或二盐酸奎宁注射作抗疟治疗。4.1.5.2输液，补充维生素，并作支持和辅助治疗。4.1.5.3对症治疗和并发症处理。4.2预防服药在高度流行区，对儿童、工地民工、疫点居民和流动人口，在流行季节成人用乙胺嘧啶50mg加伯氨喹22.5mg顿服，孕妇改用氯喹或哌喹0.3g顿服，均每10日一次。在氯喹抗性地区用哌喹0.6g，或磺胺多辛500mg加乙胺嘧啶37.5mg，均每10日一次，首次连服2日。4.3灭蚊在高度流行区或疫点，用DDT(2g/m2)滞留喷洒住屋和牲畜棚，在普遍使用蚊帐地区用溴氰菊酯(10～20mg/m2)或二氯苯醚菊酯(200～300mg/m2)浸泡(或喷洒)蚊帐。4.4防蚊提倡使用蚊帐、蚊香，利用蒿、艾等野生植物烟熏驱蚊，有条件住户装置纱窗、纱门。改变露宿习惯，减少蚊虫叮咬。4.5环境治理结合农田水利和新农村建设，填平坑洼，排除积水，平整田地，修整沟渠，加深蓄水。在有条件地区，稻田养鱼或润湿灌溉。在大劣按蚊为媒介地区，结合生产开发村庄周围的灌木林。附录A病原学检查(补充件)A1血涂片检查A1.1吉氏液染色－光学显微镜(油镜)检查A1.1.1血片制作在洁净载玻片上涂制薄血膜与厚血膜。一般从耳垂或手指取血(婴儿可在足跟取血)。先用酒精棉球消毒取血部位，然后用一次性刺血针(或用折断半边的蘸水笔尖代替，但每次使用后经煮沸消毒)迅速刺入，轻压挤出血液。用推片边缘中部取少许(0.5～1.0μL)血液在载玻片上推制成薄血膜，再用推片的角，取血约4～5μL(火柴头大小的血滴)，在同一载玻片上的适当位置涂制成直径为0.8～1.0cm的圆形厚血膜。自然干燥，用铅笔在薄血膜上、或用特种蜡笔在玻片反面编号。A1.1.2血片染色染色液用吉氏染粉10g、中性甘油500mL和纯甲醇500mL配制而成。配制时将吉氏染粉置大研钵中，逐步加入少量甘油，充分研磨后，置有色玻瓶中，用甲醇分数次洗出研钵中的甘油染液，倒入瓶内摇匀，在室温下放置3～5天，即可使用。染色前，先用甲醇固定薄血膜，将吉氏染液用pH7.0～7.2的水配成3％的稀释液，将血片插入染色缸内染色，或用滴管将此稀释液滴在厚、薄血膜上，染色30min。若需快速染色，可在2mL水中加吉氏染液3滴，染色6min。或先在厚血膜上加几滴清水溶去血红蛋白后滴加染液，效果更佳。染色后，用水轻轻冲洗，插在玻片板上晾干。A1.1.3血片镜检在染色血片上滴少许柏油，用光学显微镜(油镜)检查。应检查厚血膜为主，薄血膜主要用于原虫种类鉴别和原虫密度计数。染色后疟原虫核呈红色，胞浆呈蓝色。除环状体外，其他各期疟原虫均可查见褐色的疟色素。现症病人至少检查100个厚血膜视野，带虫者应查完整个厚血膜，未发现疟原虫判为阴性。以薄血膜中平均每100个红细胞中的原虫数或厚血膜平均每100个白细胞范围内的原虫数，推算每微升血中的原虫密度。A1.2瑞氏液染色－光学显微镜(油镜)检查A1.2.1血片制作参见A1.1.1。A1.2.2血片染色用瑞氏染粉0.2g，置于研钵内，加入中性甘油3mL，充分研磨，然后逐次加入少量甲醇至研钵内洗去染液，倒入有色玻璃瓶内，再在研钵内加甲醇冲洗，至用完100mL甲醇为止，摇匀过滤后即可使用。染色时，先在厚、薄血膜间用蜡笔划一条横线，在厚血膜上加清水2～3滴溶去血红蛋白，在薄血膜上直接加约1mL瑞氏染液染色2min，然后在薄血膜上加与染液等量的水稀释，并引到厚血膜上，使厚、薄血膜同时再染色5～6min，水洗晾干。本法不宜用于大量血片染色，但染色所需时间短，多用于医院门诊检验。A1.2.3血片镜检参见A1.1.3。A1.3荧光素吖啶橙染色－荧光显微镜检查A1.3.1血片制作参见A1.1.1，但厚血膜应比吉氏液染色的厚血膜略薄，即用3μL血涂成直径为1.2～1.5cm的亚厚血膜；薄血膜则不宜过薄，可在涂片时推片以45°角涂成较厚的薄血膜。A1.3.2血片染色先用甲醇固定薄血膜，厚血膜用清水溶去血红蛋白。用吖啶橙1g，加pH6.5～7.0磷酸缓冲液100mL配制成1％吖啶橙母液。染色时，将吖啶橙母液0.1mL加生理盐水9.9mL配成万分之一稀释液。用滴管取稀释液2～3滴于血膜上，染色40～60s，加盖玻片。A1.3.3血片镜检用荧光显微镜(或普通光学显微镜加简便荧光光源装置代替)暗室检查。疟原虫和白细胞的核呈现黄绿色荧光，胞浆呈桔红色荧光。A2骨髓穿刺按医院常规进行。本法一般不宜用于疟疾诊断，仅在特殊情况下用于鉴别诊断。附录B血清免疫学检查(补充件)B1间接荧光抗体试验(IFAT)B1.1抗原片制备常用食蟹猴疟原虫为代用抗原。以食蟹猴疟原虫感染恒河猴，待红细胞感染率超过2％，且多数原虫为裂殖体前期时取血，加肝素抗凝，经2000r/min离心15min，弃血浆，加5倍容积pH7.2的0.01mol/L磷酸盐缓冲盐水(PBS)，混匀后再次离心，弃上清液，重复洗涤3～4次，将细胞沉淀物加PBS恢复至原血量后混匀成悬液，使厚血膜每个视野有5～8个裂殖体或大滋养体。取悬液约10μL置干净载玻片的一端，推制成6.0cm×1.5cm长条形亚厚血膜，置室温中晾干或吹干。用纸包装放在有干燥剂的密封器内。在-20℃有效期为1年，在4℃有效期为3个月。用体外培养的恶性疟原虫制备抗原片，应在红细胞感染率为4％以上且以裂殖体为主时收集培养原虫，制片方法同前。B1.2血样的采集、运送和保存血清、滤纸干血滴均可应用。前者由不加抗凝剂的全血分离获得，在4℃可作运送及短期保存，-20℃可保存2年左右，但应减少反复冻融，以免影响抗体活性。后者将滤纸切成10cm×2cm纸片，在滤纸上压出直径为1.2cm的圆形印迹，从受检者的耳垂或手指取血充满圆圈，其血量约为20μL(约相当血清10μL)，编号后阴干，放入有干燥剂的密封塑料袋内，在4℃可保存半年，-20℃可保存2年。B1.3操作方法受试血清以pH7.2的0.01mol/LPBS作1∶10或1∶20稀释，或将滤纸干血滴血样部分剪碎，放在有0.1或0.2mLPBS的井内，在4℃浸泡过夜，即成相当于1∶10或1∶20的血清稀释液。对1∶10或1∶20稀释度反应阳性的血样，继续作倍比稀释(1∶40，1∶80…)进行检测，直至转为阴性。最后的阳性稀释度即为终点滴度。从冰箱中取出的抗原片，立即用电风扇吹干或在回暖后打开塑料袋，用特种蜡笔将每张抗原片划分成若干小格，每小格加一个血样或一个滴度，每批试验均设参考阳性、阴性血清及PBs空白对照。加血清后即移入37℃湿盒，30min后取出，用PBS缓慢冲洗后放入有PBS的缸内浸5～10min，用蒸馏水冲洗后再晾干或吹干。然后逐格滴加PBS稀释的1∶10的抗人IgG荧光抗体(或按产品说明)，置湿盒内37℃温育30min，然后按上述方法清洗、吹干，用荧光显微镜检查反应结果。B1.4反应标准以裂殖体及大滋养体胞浆的荧光强度及形态结构清晰程度区分：无荧光为-，荧光微弱、形态结构不清为±，荧光较弱、形态结构尚清楚为＋，根据荧光明亮度和结构清晰度的增加依次为＋＋和＋＋＋。一般以1∶20血清稀释度时十以上判为阳性。B2酶联免疫吸附试验(ELISA)B2.1可溶性抗原按IFAT方法收集食蟹猴疟原虫，或在体外培养的恶性疟原虫红细胞感染率为4％～8％且以裂殖体为主时收集培养原虫，离心洗涤3～4次，吸取沉淀上层的褐色部分装入保存管内。如当时不制备抗原，可放液氮内保存。如立即制备则放入－20℃冰箱反复冻融3次，每次1h，离心洗除血红蛋白，收集黑褐色沉淀部分，加10倍量的pH7.4的0.01mol/LPBS，以150mA的电流强度冰浴超声3次，每次1min，间隔5min，10000r/min离心30min，上清液即为可溶性抗原。为了测得此抗原的适宜工作稀释度，在酶结合物的常用浓度及参考阳性、阴性血清1∶100稀释的条件下，将抗原从1∶50，1∶100……共10个浓度稀释，包被塑料板进行检测，选取参考阳性血清光密度(OD)值为1.0的抗原稀释度作抗原适宜浓度。并按常用量用细塑料管分装，置液氮保存。B2.2操作方法用pH9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液将抗原按工作浓度稀释包被聚苯乙烯板，每井200μL，在4℃过夜。次日倾去抗原液，用pH7.4PBS/吐温20(PBS/T)灌洗3次，每次5min。加入PBS/T按1∶100稀释的待检血清，每一样本加2井，每井200μL，于37℃放置2h。取出后按前述方法用PBS/T洗涤3次，待干。加入以PBS/T稀释的过氧化物酶标记的抗人IgG结合物(一般为1：1000)，每井200μL，于37℃放置2h。按前述方法洗涤3次后待干。每井加入过氧化氢(H2O2)底物系统溶液〔邻苯二胺(OPD)10mg＋pH5.0柠檬酸－磷酸盐缓冲液25mL，用前加33％H2O210μL，避光存放］200μL，于37℃放置30min。每井再加入2mol/L硫酸50μL终止反应。B2.3反应标准用酶标专用比色计读取492nmOD值。取每一样本两孔的OD值的平均值。OD值测定前先以有1/5的2mol/L硫酸底物溶液校正零点。通常以OD值≥0.4为阳性阈值。为了便于比较和减少误差，每板应设参考阳性、阴性血清及PBS/T空白对照，并测OD值。以式(B1)对各个血样的OD值进行校正：附溶液配制方法：pH7.20.01mol/LPBSKH2PO40.38gNa2HPO41.02g(或Na2HPO4·12H2O2.58g)NaCl8.0g蒸馏水加至1000mLpH7.4PBS/TNaCl8.0gKH2PO40.2gNa2HP