第十五章移植的检查

第十五章移植的检查移植（transplantation）是指将一个体的细胞、组织或器官用手术或其他方法移植到自体或另一个体的某一部位。移植的细胞、组织或器官称为移植物，提供移植物的个体称为供者（donor），而接受移植的个体称为受者（recipient）。根据移植物来源及供、受者遗传背景的差异，将移植分为四种类型：①自体移植（autograft）：是指把来自移植受者本身的组织移植到受者；②同种同基因移植（syngraft）：是指遗传结构完全相同或非常相似的个体（同卵孪生子或近交系动物）之间的移植；③同种异基因移植（allograft）：是指同一动物种内遗传结构不同个体之间的移植；④异种移植(xenograft)：是指不同动物种个体之间的移植，如动物器官移植给人。现代移植学科的发展已经可将多种细胞、组织或器官进行移植，输血是较早开展的细胞移植，肾移植是最早成功的器官移植。随着放射疗法、免疫抑制药物的应用和器官保存技术、植入技术的提高，肾、肝、肺、心脏和骨髓移植已成为很多病人组织器官功能衰竭末期唯一的根治性治疗手段。受者与移植物之间的排斥反应是移植成功的主要障碍。移植排斥（transplantationrejection）是指受者免疫系统识别移植抗原后产生免疫应答，进而破坏移植物的过程。引起移植排斥的抗原为移植抗原（transplantationantigen），即组织相容性抗原，人类的主要组织相容性抗原称为人类白细胞抗原（humanleukocyteantigen，HLA抗原），是主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex,MHC)的编码产物，是移植排斥的分子基础。HLA-I类抗原（HLA-A、B、C）广泛表达于一切有核细胞表面，II类抗原（HLA-DR、DQ、DP）主要表达在活化的巨噬细胞、B细胞、树突状细胞等抗原提呈细胞、血管内皮细胞及活化的T细胞表面。自体移植和同种同基因的移植不发生排斥。在同种异基因移植或异种移植中，移植成功的关键取决于供、受者间组织相容性抗原是否一致或相近。根据排斥反应发生的时间、强度及病理学改变可分为超急性排斥、急性排斥和慢性排斥反应。①超急性排斥反应（hyperacuterejection）是在移植物血液循环恢复后数分钟或数小时（也可在24~48h）内发生的排斥反应，由体液免疫介导，其原因是受者体内预先存在抗供者同种异型抗原（如HLA抗原、ABO血型抗原、血小板抗原等）的抗体。移植术后，抗体与移植物细胞表面相应抗原结合，激活补体，导致血管通透性增强，中性粒细胞和血小板聚集，纤维蛋白沉积，血管内凝血和血栓形成；组织病理学特点是早期引起毛细血管内大量中性粒细胞聚集，小动脉血栓形成，继之出现缺血、变性、坏死。超急排斥反应可见于移植术前反复多次输血、多次妊娠、长期血液透析或再次移植的个体，也可由于移植抗原与病原微生物具有共同抗原所致。②急性排斥反应（acuterejection）是同种移植后最常见的排斥反应，多发生在移植后1周至3个月内，其发生机制是：①体液免疫应答，受者产生针对移植物血管内皮细胞MHC抗原的IgG类抗体，通过激活补体而导致细胞损伤；②细胞免疫应答，移植物内皮细胞表面的同种抗原激活T细胞。CD4+T细胞产生细胞因子，活化炎症细胞；细胞毒T细胞可直接杀伤靶细胞，造成移植物血管内皮损伤。③慢性排斥反应（chronicrejection）多发生于移植术后数月或数年，病程缓慢。目前认为慢性排斥反应是急性排斥反应反复发作的结果，导致移植物组织的退行性变。细胞免疫和体液免疫应答均参与慢性排斥反应。移植的检查主要是移植前检测同种异体抗体和HLA分型，选择最合适的供者和受者。骨髓或造血干细胞移植时，须计数移植物中造血干细胞的数量，判断造血干细胞采集的最佳时机。移植后的实验检查可了解移植物的存活状况、功能，并指导免疫抑制剂治疗和监测移植排斥反应等，对成功移植具有重要意义。一、同种异体抗体检测器官移植受者体内预存抗体，主要来自天然血型抗体。受者因多次妊娠、反复输血和接2受血液制品，接受过异种或异体移植，或者某些细菌／病毒感染后由类属抗原诱生的抗HLA抗体或其他针对组织细胞的抗体，尤其是与血管内皮细胞抗原结合的抗体，当这些预存的抗体进入移植器官后，与其血管内皮细胞的细胞膜抗原结合形成抗原抗体复合物，激活补体导致血管损伤，移植物受损。移植前筛选出这些抗体，防止超急排斥和急性排斥反应，提高移植物存活率具有重要的意义。㈠适应证：各种移植术前筛选供者和受者。㈡标本采集1、供者为肝素抗凝血、受者为血清。18~25℃保存并尽快送检，避免污染细菌等。2、血清标本可在室温保存24h；2~8℃可保存一周；长期保存应置于-80ºC。避免反复冻融。标本应避免溶血。㈢检测方法1、补体依赖淋巴细胞毒试验补体依赖淋巴细胞毒试验(complementdependentcytotoxicity,CDC)是通过检测受者血清中是否存在有针对供体的补体依赖的淋巴细胞毒抗体，以此来确保同种异体移植不发生超急性或急性排斥。CDC的原理是：被检血清中的抗体与供者淋巴细胞膜表面相应抗原结合后激活补体，引起细胞膜破损，这种抗体称细胞毒抗体。如将含有此抗体的血清与淋巴细胞和补体共同孵育，淋巴细胞将被破坏，细胞膜通透性增加，染料得以渗入使细胞着色。根据着色的死细胞数目，可以估计淋巴细胞毒的强度。2、群体反应性抗体测定群体反应性抗体（panelreactiveantibodies,PRA）是指群体反应性抗HLA-IgG抗体，是各种组织器官移植术前筛选致敏受者的重要指标，与移植排斥反应和存活率密切相关。PRA的常用方法：①ELISA-PRA：酶标板用纯化的包括当地人种绝大部分的HLA特异性抗原预先包被，检测时将待检血清加入并孵育一定时间后，加入酶标记的抗人IgG或IgM的人单克隆抗体，再加入酶作用的底物显色，根据颜色的深浅，可测定出HLA抗体的特异性和滴度。②CDC-PRA：在预先用淋巴细胞（含当地人种绝大部分的HLA特异性抗原）包被的微孔板中加入受者血清和补体，反应一定时间后用染料染色，计数死细胞（被染色的细胞）百分率，并由此判断PRA阳性或阴性。3.流式细胞术交叉配型流式细胞术（flowcytometriccrossmatching,FCC）测定供者淋巴细胞反应性同种抗体，具有高度的灵敏性。FCM的原理是：将受者血清与供者淋巴细胞共同孵育后，用荧光素标记的抗人IgG或IgM的单克隆抗体进行免疫荧光染色，在流式细胞仪分析荧光强度的强弱及阳性细胞百分率，从而判断受者血清中有无抗供者淋巴细胞的HLA抗体存在。㈣参考范围1、CDC法：10%为阴性，10%为阳性。2、ELISA-PRA或CDC-PRA：＜10%为阴性，＞10%~50%为阳性，＞50%为强阳性。3、FCC：10%为阳性。㈤临床意义1、移植前筛查致敏受者：器官移植受者体内预存抗体，尤其是特异性抗HLA抗体，是影响移植物存活和排斥反应的重要因素，移植前筛选出这些抗体具有重要的临床意义。补体依赖淋巴细胞毒试验只能检测受者体内的补体依赖性抗体，但无法确定是IgG或是IgM抗体，然而影响移植效果的却只是特异性的IgG抗体；ELISA-PRA法既可测补体结合的，也可测非补体结合的抗HLA-IgG抗体，且不受IgM干扰和感染的影响等而得到广泛应用，尤其对于二次移植以及有过妊娠和输血史的受者应作为一项必须进行的检测项目。由于CDC-PRA能反映受者体内的抗体活性，目前在临床上仍在使用。移植前抗体水平对器官存3活有明显影响。资料显示：首次移植时，10%~50%致敏的受者较10%的无致敏状态者一年半移植肾存活率低7％，50％的受者移植肾存活率低50％；10%的患者，移植后延迟器官功能发生率明显高于10%的患者。由于HLA抗体的波动及输血等因素的影响，肾移植前受者应定期检测其血清HLA抗体，一般每月至少一次。2、监测移植后排斥反应：受者移植后抗HLA抗体的产生和排斥反应与急性排斥反应和慢性排斥反应的发生有关。肾移植术后发生急性排斥反应的患者经流式细胞术分析发现，40%的病例存在抗供者抗体，而未发生排斥反应的仅有9%带有抗供者抗体；慢性排斥反应患者中57%能找到此类抗体，移植物存活4年以上的病例仅2%~4%带有此类抗体。因此，抗供者抗体的检测可做为术后排斥反应的一种监测方法。㈥评价与问题1、淋巴细胞毒试验是补体依赖的，补体的质量直接影响到试验结果的准确性，故要妥善地保管好补体。补体应避免受热或反复冻融；兔补体应保存于-80ºC冰箱，在-20ºC只能保存3个月。补体依赖的淋巴细胞毒试验只能检测补体结合的抗体。IgM对结果有干扰作用。2、ELISA-PRA法既可检测补体结合的，也可测非补体结合的抗HLA-IgG抗体。不受IgM的干扰和感染的影响。3、FCC比淋巴细胞毒法灵敏度更高，但目前尚未普及。4、抗供者抗体的检测有其固有的局限性：由于移植器官可以吸收一定量的抗体，结合到血管内皮上的抗体可被溶解、吸收，所以循环中可能测不到抗供者抗体的存在，并不能说明无体液免疫的损伤。5、为了查明受者血清中是否存在自身抗体，必要时可进行自身交叉配型（autocrossmatching）试验，即用受者自身淋巴细胞和血清进行细胞毒试验，若存在自身抗体，可出现阳性反应。自身抗体存在可造成FCC出现假阳性。二、HLA分型及其检查器官移植成功的关键是选择适合的供受者，即ABO血型相符，HLA型别相同或相近。目前认为HLA-DR位点抗原是最重要的，HLA-DQ、DP在移植中亦有重要意义，其次是HLA-A、B抗原，HLA-C对移植过程意义较小。移植前的组织配型或组织相容性试验，是指对某一个体的表型和基因型的HLA特异性鉴定。通过组织配型试验，选择与受者组织相容性抗原近似的供者，可降低急性移植排斥反应发生的频率和强度，从而延长移植物的存活。供者与受者的ABO血型一致是各种移植的前提。肾脏移植的长期存活与供、受者HLA抗原，特别是HLA-DR抗原相容性密切相关。骨髓移植时则要求HLA抗原完全一致，否则会出现剧烈的移植物抗宿主反应。㈠适应证：各种移植术前筛选供者和受者㈡标本采集1、肝素抗凝血2、常规分离淋巴细胞后立即检测。3、淋巴细胞悬液避免污染有脂肪、细菌以及其他杂质等颗粒。㈢检测方法1、血清学分型：HLA血清学分型采用补体介导的细胞毒试验，其原理为：使用标准的HLA分型抗体与受者的淋巴细胞混合，加入补体，抗体与HLA抗原特异结合后激活补体，使淋巴细胞膜受损或裂解，然后用染料（台酚蓝或伊红）染色，通过在显微镜下计数死亡淋巴细胞的百分比判定结果。死亡细胞死亡百分率高为阳性，说明待检淋巴细胞的HLA型与标准HLA型一致；阴性时说明待检淋巴细胞的HLA型与标准分型抗体HLA不一致。血清学分型法主要用于检测HLA-A、B、C位点上的抗原。2、混合淋巴细胞培养（mixedlymphocyteculture,MLC）：将供者与受者的淋巴细胞混4合在一起进行体外培养一定时间后，由于二者细胞表面HLA抗原不同，淋巴细胞通过识别对方HLA抗原而活化增殖并转化为淋巴母细胞，通过判定淋巴细胞转化情况，确定混合淋巴细胞反应（mixedlymphocytereaction，MLR）的强弱，二者HLA差异越大，MLR越强，反之越弱。MLC分为单向法和双向法，单向法是先将刺激细胞（供者来源）用Ｘ线、丝裂霉素处理，阻止淋巴细胞DNA合成，使其失去活化能力，但保留其抗原性，将此处理过的刺激细胞和反应细胞（受者）混合培养3天，再加入３H－TdR继续培养12h，而后收集细胞，置闪烁计数器内测定掺入细胞内的３H－TdR的cpm值，计算刺激指数（stimulationindex,SI），来反映MLR的程度。双向法的培养时间和测定方法与单向MLC相同，所不同的是两个体的淋巴细胞不经任何处理而进行培养，两个体的淋巴细胞都有具有刺激能力和反应能力。⒊HLA的基因分型由于应用血清学方法对HLA-II类抗原（DR、DQ、DP）的配型较为困难，因此推动