病毒蚀斑技术

病毒蚀斑技术1952年，Dulbecco把噬菌体空斑技术应用于动物病毒学，从而使病毒蚀斑技术(Virusplaqueformation)成为许多病毒的滴定和研究方法。(一)原理病毒感染细胞后，由于固体介质的限制，释放的病毒只能由最初感染的细胞向周边扩展。经过几个增殖周期，便形成一个局限性病变细胞区，此即病毒蚀斑。从理论上讲，一个蚀斑是由最初感染细胞的一个病毒颗粒形成的，因而该项技术常用于病毒颗粒计数和分离病毒克隆。但在实际操作中，常出现几个病毒颗粒同时感染一个细胞的情况，影响滴定的准确性和克隆的纯一性，为此，接种的病毒液要充分分散和稀释。对于细胞结合性病毒，如MDV，需用单层细胞；对细胞释放性病毒，即可用固相介质悬浮的细胞，也可用单层细胞，但后者需用琼脂等固体介质盖在细胞上，以防释放的病毒在液体介质中流动。固体介质的浓度由病毒的大小而定，大病毒用浓度较低的介质，小病毒用浓度较高的介质，以便将蚀斑的生长速度控制在适宜的范围内。小蚀斑需用显微镜观察，1-10mm的大蚀斑可用肉眼计数。为便于肉眼观察，常用中性红等染料染色。因病变细胞不吸收中性红，病变细胞区便呈现无色蚀斑。病毒悬液的滴度以每毫升蚀斑形成单位(PFU/ml)来表示。例如，3个细胞瓶的平均蚀斑是58，接种量为0.2ml，病毒的稀释度为2.5×103，则病毒原液的滴度为：58÷0.2×2.5×103＝7.25×105(PFU/ml)(二)技术应用蚀斑技术可以应用于分离病毒的克隆(无性繁殖纯系)、病毒或血清的滴定，也可用蚀斑形态和大小研究病毒的生物学特性。1.病毒生物学纯化(Virusbiologicalpurification)在进行血清中和试验时,常常会出现标准病毒株的滴度下降，因而影响了试验的准确性,这种情况多见于虫煤病毒。这可能是由于原始毒种的混杂,或者已有许多变异病毒粒子存在其中,甚至出现数量众多的缺陷病毒所致。这时,有必要把手上掌握的标准毒株进行纯化,应用病毒蚀斑技术,挑选出各个不同的纯化病毒,亦称“克隆株”。克隆后的病毒经在敏感细胞上增殖,测定其滴度,选用合适的毒株用于血清中和试验。为了更有效地进行纯化,必须在覆盖营养琼脂之前用营养液洗去单层细胞上未被吸附的病毒。同时要控制好稀释的浓度,一个培养瓶中的蚀斑数目最好不超过10个，挑取在其附近10mm都是健康细胞的蚀斑。挑取后的病毒应传两代或两代以上。一般认为，中性红染料会由于“光敏”作用而抑制病毒蚀斑的形成和破坏宿主细胞。因此，加了中性红覆盖层的培养物应在暗处培养。2.蚀斑减少中和试验(PlaqueReductionNeutralizationTest)蚀斑减少中和试验是检测血清中和抗体的一种敏感性较高的方法，试验以使蚀斑数减少50％的血清稀释度作为其中的效价。试验使用定量的病毒(100PFU)与不同稀释度的等量血清混合后感作,接种预先准备好的单层细胞,再覆盖上营养琼脂置37℃二氧化碳培养箱培养,数天后分别统计蚀斑数,用Karber法计算该血清的蚀斑中和效价。其操作原理与传统的血清中和试验大致相同。由于本试验的操作比较繁锁，目前在国内极少应用,国际上也没有把它作为一种各国都接受的诊断方法，仅在OIE国际动物卫生法典(第六版)中列为对裂谷热的规定诊断方法之一。(三)操作实例1.赤羽病病毒(AKV)的滴定或纯化(1)于55mm直径的灭菌塑料培养皿中培养绿猴肾细胞(Vero)，使形成单层。细胞培养时间约3－4天，接种量约为2000000/ml个细胞。选取单层细胞全部覆盖，不留有空洞的培养皿用作试验。(2)用细胞培养液对AKV病毒作10倍倍比稀释至10-7并保存于4℃。(3)每个稀释度的病毒液接种3个平皿。(4)接种前弃去细胞培养液,用5mlPBS或细胞培养液冲洗单层细胞,然后弃去冲洗液。(5)每个平皿分别加入0.2ml病毒稀释液，对照组只用细胞培养液代替，置37℃二氧化碳培养箱吸附一小时，每15分钟摇动一次，以便使病毒均匀分布。(6)按第4步骤冲洗未被吸附的病毒。(7)取2倍浓缩的细胞培养液加入等量的1.5％琼脂(预热)中，每个平皿加入7ml，置平台待冷却凝固后于37℃二氧化碳培养箱培养约2天，平皿需倒置。(取2倍浓缩的细胞培养液加入等量的2％琼脂(预热)中，每个平皿加入5ml，置平台待冷却凝固后于37℃二氧化碳培养箱中培养至次日。(9)结果计算求每组三个培养皿的蚀斑平均数，组间蚀斑数的差异应符合稀释度的规律(即若10-2组平均100个蚀斑，则10-3组平均应在10个左右)，否则应考虑重新试验。以平均蚀斑数乘以病毒稀释的倍数再乘以5，即为每毫升病毒原液的蚀斑数。(10)选取特征性的若干蚀斑，分别以弯头吸管在琼脂层下吸取蚀斑以收获病毒，然后分别接种到预先制备的单层细胞培养瓶中进行增殖或传代。(11)本试验采用BHK21细胞，可应用于牛流行热病毒(BEFV)。2.蓝舌病病毒(BTV)血清型鉴定试验(纸片法)(1)抗体纸片制备①取已知各种血清型毒株以1×107蚀斑形成单位接种绵羊,接种后3-4周采血分离血清。②制备直径0.5mm的中性滤纸片，121℃15分种灭菌后保存于干燥环境。③取上述滤纸片浸入不同血清型的免疫血清后真空冻干,保存于4℃冰箱备用，使用前以灭菌水湿润。(2)病毒接种①用直径6cm的塑料培养皿培养BHK21或Vero细胞使成单层。②以103PFU/0.2ml被检蓝舌病病毒接种于细胞上,吸附1h。③洗去未被吸附的病毒，弃去洗液。(3)覆盖琼脂①取2倍浓缩的细胞培养液加入等量的1.5％琼脂，每个平皿加入7ml，置平台冷却凝固。②在琼脂面上按梅花形图案放上不同型的血清滤纸片,并做好记号。③把平皿放置在37℃二氧化碳培养箱培养2天。④真空吸出平皿中的滤纸片。⑤取2倍浓缩的细胞营养液加入等量的2%琼脂，每个平皿加入5ml，重新置37℃二氧化碳培养箱培养2-3天,待明显蚀斑抑制环出现。(4)结果判定出现明显抑制蚀斑形成(即滤纸片位置下仍保持活细胞被染色)的免疫血清即为该被检病毒的血清型。注：本试验方法同时可应用于鹿流行性出血病病毒(EHDV)与蓝舌病病毒(BTV)的鉴别。3.新城疫病病毒(NDV)分离(1)取疑似患病禽的组织用细胞培养液匀浆,离心沉淀后取上清液。(2)用16孔微量培养板制备鸡成纤维原代细胞。(3)细胞长成单层后吸去培养液，向每孔滴加0.1ml被检病料,置37℃吸附2小时后弃残液。(4)制备1％琼脂的BME，置40－50℃水浴待用。(5)吸取上述琼脂加入培养板各孔，每孔0.5ml，使冷却凝固成覆盖层。(6)把培养板倒置，在37℃二氧化碳培养箱培养48h。(7)制备含0.002％中性红的1%琼脂的BME，置40－50℃水浴待用。(吸取上述琼脂加入培养板各孔，每孔0.5ml，使冷却凝固成第二覆盖层。(9)把培养板倒置，在37℃二氧化碳培养箱继续培养，48小时内观察结果。(10)挑出蚀斑下的细胞作病毒的进一步增殖和鉴定。注：本试验方法在样品中病毒含量少的情况下比单纯用细胞培养分离要敏感。4.试验用各种成份的配制(1)细胞营养液(用于稀释病毒)10倍199保存液4ml牛血清0.8ml3%碳酸氢钠2.4ml双蒸水32.8ml40ml(2)两倍浓缩细胞营养液(配制首层琼脂用)10倍199保存液20ml牛血清4ml3％碳酸氢钠12ml1％二乙氨基乙基(DEAE)10ml(可选择)双蒸水54ml100ml(置40－45℃水浴备用)(3)1.5％琼脂精制琼脂糖1.5g双蒸水加至100ml(0.112MPa高压灭菌15分钟，置40－45℃水浴备用。)(4)含中性红两倍浓缩细胞营养液(配制第二层琼脂用)10倍199保存液20ml牛血清10ml3％碳酸氢钠12ml0.5％中性红6ml双蒸水52ml100ml(置40－45℃水浴备用)说明：在第二层琼脂中，中性红的最终浓度应为1:5000－1:10000。(5)2％琼脂精制琼脂糖2g双蒸水加至100ml(0.112MPa高压灭菌15分钟，置40－45℃水浴备用。)（6）结晶紫溶液配置：Crystalvioletstain:stock=1g.crystalviolet99ml20%EtOHworkingsoluion=20mlstock40ml95%EtOH150mldistilledwater---------------------------------------------------------------------------Crystalviolet-Formaldehydestain:100ml10ml37-40%formalin90mldH2O0.4gNaH2PO4(monobasic)0.65gNa2HPO4(dibasic)0.1gcrystalviolet计数：Pfu/ml(oforiginalstock)=1/dilutionfactorxnumberofplaquesx1/(mlofinoculum/plate)----------------------------------EV71Plaqueassay.RDcells(1×105)in200μlRPMI1640wereseededineachwellofa24-wellplate.Serialdilutionsofthedifferentviralsuspensionswereaddedtothewellsfor18hofincubation.Afterabsorptionfor1hat37°C,thevirussupernatantwasreplacedwithDMEMcontaining2%FBSand0.8%methylcellulosefor72h.Aftertheremovalofthemediumanda15-minfixationstepwith4%formalininPBS,theplaqueswerereadbybeingstainedwith1%crystalviolet.CountswereexpressedasPFUpermilliliter.我也用Viscousmedium做病毒空斑实验，甲基纤维素覆盖培养液具体配方如下，供参考：Inaglassbottle,combine8.8gmethylcellulose(4000centipoise,Sigma)with320mldistilledwater.Stirwithalargemagneticstirrer.Autoclave30minat121℃,leavingthemagneticstirrerinsidethebottle.Removefromautoclavewhilestillhotandstiragainuntilmethylcellulosehascompletelydissolved(usuallyafewhours).Add40ml10×MEMor10×DMEM,40mlFBS,40,000Upenicillin,40mgstreptomycin,and4mlof1MHEPES.AddL-glutamineandsodiumbicarbonateaccordingtothemediumsuppliersrecommendations.Storeupto6monthsat-20℃.配置此Viscousmedium确实挺麻烦，所用试剂多，甲基纤维素是难溶解，不过我按上述方法大概两三天内也溶好了。只要配好了甲基纤维素溶液，其他步骤都简单了。