病理切片笔记

病理检验技术讲稿一、组织切片常用仪器与制片技术1、切片机及使用切片机提供石蜡切片（或炭蜡切片）用，是切片中最常用的一种。超薄切片机的构造与使用原理基本也属于这一类型。（图4-1-1）摇动轮的手柄转动重轮时，传动机内一组齿轮及螺纹中轴，使中轴前端的组织块固定架即按所调节的切片厚度（μm）向前推进，并上下运动，让组织块经过前下方的轮时，传动机内一组齿轮及螺纹，使中轴前端的组织块固定架即按所在切片操作轴前先打开卡锁，否则重轮不能转动。然后，将组织块固定于固定架，最后再装切片刀。组织块及切片刀先后装牢固后才可掀开卡锁。慢慢转动重轮使装有组织块的中轴稍下降到接近刀刃处，调整刀的前、后进度，使刀刃即将接触组织块。调整刀的进度时，不让刀刃接触组织块，以免第一次切到时崩落组织块。此时将组织进度调节器，调节到20μm，开始切片，待组织块切到所需的组织图4-1-1旋转式切片机断面时，再调节到所需的切片厚度，如5μm或其它厚度。在装组织块前，可将组织蜡块予以修整；如切成方形的断面使组织周围的空白勿超过1-3mm宽，组织前面的蜡也尽量切去到能清晰看到组织本身，这样在切片机上切片时可节省不少的切片时间。在切片机上切片时，如发现因切片刀有缺口而致组织块出现划痕时，应稍向左、右移动切片刀避开切口，再正式切片。旋转式切片机一般不宜切大块组织（不超过1.8cm），切片时转动重轮的速度也要均匀适宜，太快或太慢均不易切成石蜡连续切片带。结构优良的切片机可在组织块另行处理后能切成1μm厚的“半薄切片”。切片工作结束后应先卡紧卡锁，再卸下切片刀，最后卸下组织块，做其他处理。任何切片技术工作者都应养成先卡紧卡锁再在机上操作的良好习惯。这样就完全可以避免切片刀伤人或砸坏组织块及切片刀的事故发生。2、脱水机：（图4-1-2）脱水机是对动物标本按程序浸于各种溶剂进脱水、透明、侵蜡的精密仪器，根据需要，可分别使用不同功能的脱水机。生物组织自动脱水机的脱水筐体积较大，能同时对120～150块组织进行脱水并且运转可靠，控温、定时准确，脱水效果好，使用维修方便，特别是采用单缸揭盖技术，减少了空气污染等功能。有的机器还有交直流电源两用，市电停电后，由后备直流电源给整机供电，完成脱水全过程；有的机器还设有延时加热的功能，在组织入蜡缸前4小时自动开始加温，即节约了能源，又延长了机器寿命。还有的机器还编入了多套程序，可供不同组织、不同的制片图4-1-2数显组织自动脱水机目的选择使用。3、切片制作技术1）、取材组织取材的方法是制作切片的一个重要程序，必须根据教学和科研的具体要求取自人体（外科手术切除标本、活检标本、尸检标本）或动物，并确定取材的部位和方法，否则对组织结构就看不全面。取材者需要掌握解剖学、组织学、病理学的基本理论知识，还要掌握实际操作技术，每个组织器官的取材都有一定的部位和方法，不能任意切取组织作为制片材料，不然，无法达到教学和科研的目的，具体要求如下：(1)、材料新鲜：取材组织愈新鲜愈好（人体组织一般在离体2小时以内取材），动物组织则应在处死后立即取材，并迅速固定，以保证原有的形态学结构。(2)、组织块的大小：所取组织块较理想的体积为1.8X1.0X0.2cm，以使固定液能迅速而均匀地渗入组织内部，但根据制片材料和目的不同，组织块的较理想体积也不同，如制作病理外检、科研切片，其组织块可以薄取0.1～0.2cm即可，这样可以缩短固定脱水透明的时间，若制作教学切片报厚取0.3～0.5cm，这样可以同一蜡块制作出较多的教学切片。(3)、勿挤压组织块:切取组织块用的刀剪要锋利，切割时不可来回挫动。夹取组织时切勿过紧，以免因挤压而使组织、细胞变形。(4)、规范取材部位:要准确地按解剖部位取材，如胰腺，一般取胰岛较多的胰腺尾部；脊髓取腰膨大与颈膨大处，病理标本取材按照各病变部位、性质的不同，根据要求规范化取材。(5)、选好组织块的切面:根据各器官的组织结构，决定其切面的走向。纵或横切往往是显示组织形态结构的关键，如长管状器官以横切为好。(6)、保持材料的清洁:组织块上如有血液、污物、粘液、食物、粪便等，可用生理盐水冲洗干净后入固定液。(7)、保持组织的原有形态:新鲜组织固定后，或多或少产生收缩现象，有时甚至完全变形。为此可将组织展平，以尽可能维持原形。神经、肌肉组织等可将其两端用线扎在木片或硬纸片上固定。(8)、动物品种的选择:如观察肥大细胞，以取材于大、小鼠皮下组织及肠系膜、大网膜组织直接作铺片为好；内耳、胰岛细胞的观察，多取材于豚鼠的内耳和胰腺；运动终板的观察多取才于小鼠的胁间肌。2）、固定（1）、小块组织固定法：从人体或动物体取下的小块组织，须立即置入液态固定剂中进行固定，标本：固定液为1：4～20，这是最常用的方法，但组织块不易过大过厚，否则固定液不能迅速渗透。故取组织块的大小一般为1.8X1.0X0.3cm为宜。组织块厚度不易超过0.5cm，如需厚度超过0.5cm，最好置入冰箱冷藏室内固定，冷藏固定时间适当延长，特别是组织化学实验用的材料，冷藏固定效果会更好。（2）、注射、灌注固定法：某些组织块由于体积过大或固定液极难渗入内部，或需要整个脏器或整个动物体进行固定。这时宜采用注射固定或灌注固定法。将固定液注入血管，经血管分枝达整个组织和全身，从而得到充分的固定。（3）、蒸汽固定法：比较小而厚的标本，可采用锇酸或甲醛蒸汽固定法。多用于涂片、印片及压片标本的固定。如血液涂片，则应在血片末干燥前采用锇酸或甲醛蒸汽接触固定。操作时，应先将有盖玻璃容器内加入适量1-2%锇酸水溶液或10%甲醛溶液，将涂片标本放入高出固定液面1cm以上的固定架上，待盖好容器盖后加温55℃左右，1～5分钟即可。常用的固定液有两大类即单纯固定液和混合固定液，其种类繁多，最常用的单纯固定液有10%甲醛固定和95`%乙醇固定液。最常用的混合固定液有：·酒精-甲醛固定液（95%酒精9份、40%的甲醛1份）；·Zenken氏液（重铬酸钾2.5克，升汞5.0克，蒸馏水100ml,冰醋酸5ml）；·Bouin氏液（苦味酸饱和水溶液25ml,40%甲醛25ml，冰醋酸5ml）等。3、脱水透明标本经过固定和冲洗后，组织中含有较多的水分，必须将组织块内的水分置换出来，这一过程叫做脱水。无论是用石蜡切片，还是用火棉胶切片，都必须除去组织中所含水分，因含水组织与石蜡、火棉胶等包埋材料不相容，常用的脱水剂为一系列不同浓度的乙醇。脱水的步骤是：80%、90%、95%、100%各种浓度乙醇2小时，此过程可用脱水机自控完成。丙酮也是一种脱水能力很强的脱水剂，但因其脱水能力很强，对组织有剧烈收缩作用，在制作科研、教学切片时一般不用该试剂。但因其沸点低，脱水力强，加温至沸点时在短时间内可脱水彻底，故病理外检快速石蜡切片时可用丙酮脱水剂。因乙醇、丙酮等不溶于石蜡，还要经过一个能溶于石蜡的溶剂替代过程称为透明。常用的透明剂有二甲苯、三氯甲烷、冬青油等。4）、浸蜡、包埋（1）、浸蜡熔点：石蜡分为软石蜡与硬石蜡两种，熔点为42～54℃一般称为软蜡，熔点为56～62℃称为硬蜡。浸蜡时，应先经软蜡再经硬蜡，（常用的浸蜡熔点为52～54℃、54～56℃、56～58℃Ⅲ级浸蜡），使组织中含有的透明剂完全去尽。（2）、浸蜡温度：浸蜡的温度应高于熔点的2～5℃为宜，温度过高可致组织过度收缩或变脆，如在温箱内浸蜡，要将温度控制在60～65℃的范围。（3）、浸蜡的时间：可根据组织块的大小及其组织种类而定。一般厚度约0.2cm的实质性器官（肝、肾、脾等）的浸蜡时间约为2～3小时，内窥镜镊取小标本的浸蜡时间约1小时，组织块多时需增加浸蜡时间。（4）、包埋：将浸蜡后的组织置于融化的固体石蜡中，石蜡凝固后，组织即被包在其中，称蜡块，此过程称为包埋。包埋用的石蜡和加温的镊子均不能温度过高，防止组织被烫伤，破坏组织结构。包埋用的蜡温度应与组织块本身的温度相等，如温度不一，可造成组织与周围石蜡脱裂的现象。包埋所用的石蜡要求无杂质，并有一定的粘韧性。蜡的熔点与组织块相适应，过硬的组织（如骨组织、肌肉组织、皮肤等）可用，必要时加以过滤以免异物或残渣污染组织或损害切片刀。组织包埋时亦可用包埋机操作。5）、切片和贴片用硬度较高的石蜡包埋。包埋用的石蜡可以重复使（1）、修整蜡块：可视其组织的大小，在组织边缘约0.1-0.2cm处，切去余蜡部分，否则易造成组织皱缩不平。图4-1-3组织包埋机（2）、准备好切片用具：磨好并经过镜检的切片刀、毛笔、眼科镊子（弯）、单面刀、加温的水盆或切片漂烘温控仪、夏天须准备好冰块。（3）、安装蜡块：将修好的蜡块安装在金属或木制持蜡器上，如蜡块较多并较大可直接安装在切片机的组织块夹持器中进行切片，但夹持器螺旋不能旋的过紧，否则蜡块被压裂。（4）、安装切片刀：将切片刀安装在切片机的刀台上，把刀台上的紧固螺丝旋紧，使切片时不产生振动，能保持一定的切片厚度。（5）、切片刀与蜡块的角度：切片刀与蜡块应有一定的角度，系指刀锋的下面和水平面所形成的角称倾角又称清扫角。此角若过大则切片上卷，过小则切片皱起。若用平凹面刀，则平的一面必须向着蜡块，凹面向外，将预定使用的刀口部位移至蜡块的下方，调节蜡块夹持器的方向螺旋，使蜡块平切面与刀峰准确平行。刀的倾角一般以4°～10°为宜，双平面刀侧角以12°～15°为宜，如切较硬的组织倾角以30°左右为宜。（6）、切片的厚度：切片机的厚度调节器上刻有0～50μm或0～25μm，可任意选择其厚度，石蜡切片的厚度一般在4～6μm。（7）、切片：用右手握住切片机旋转轮的手柄，左手握住微调推进器的手柄，调整组织块前后的进度，待组织块即将接触刀刃时，再用左手缓慢移动微调推进器的手柄，右手上下移动旋转轮的手柄进行“粗切”，待组织“切全”后，松开左手，以右手转动旋转轮，石蜡便被切成一条蜡带，即谓石蜡连续切片，这时左手持毛笔牵引着蜡带向前拉，到一定长度便可用毛笔轻巧取下。（8）、铺片：用眼科镊子镊起蜡带轻轻平铺在40～45℃的水面上，借水的张力和水的温度，将略皱的蜡带自然展平。（9）、贴片、烘片：待切片在恒温水面上充分展平后，用镊子将每一张蜡片分离，将洁净的栽玻片垂直插入水中，轻轻将其捞到栽玻片的中段处倾去栽玻片上的余水用钻石笔在载玻片的一侧写上标本的编号后放在烤片架上，置入60～65℃恒温箱内或切片漂烘温控仪的烘箱内烤片15～30分钟，脱去溶化组织间隙的石蜡即可染色。6）、染色和封片常用的染色方法是苏木素-伊红（HematoxylinEosin）染色法,简称H.E染色法.这种方法对任何固定液固定的组织和应用各种包埋法的切片均可使用。苏木素是一种碱性染料,可使组织中的酸性物质(又称嗜硷性物质)染成兰色，如细胞核中的染色质等；伊红是一种酸性染料，可使组织中的碱性物质(又称嗜酸性物质)染成红色，如多数细胞的胞质、核仁等在H.E染色的切片中均呈红色，很容易与胞核区别，染色剂多为水溶液，故染色前必须先经二甲苯脱蜡，再用乙醇由高浓度到低浓度脱苯、复水，最后用流水洗去乙醇，即可染色。先用苏木素染细胞核，用自来水洗去切片上的染液，再用1%盐酸乙醇分色，分色的目的是去除细胞核以外不应着色部分的颜色，使细胞核着色清晰适度。颜色分辨鲜明。分色时间凭经验控制。分色后用流水充分洗涤去除余酸。最后用0.5%的伊红液染细胞质。染色后的切片，因组织内含水而不透明，需再次用乙醇脱水、二甲苯透明。为了达到长期保存的目的，在切片标本上滴加树胶，再加一盖玻片，此过程为封固。H.E染色程序如下:(1)、脱蜡、脱苯、复水：二甲苯Ⅰ1分钟二甲苯Ⅱ1分钟无水酒精Ⅰ30秒无水酒精Ⅱ30秒95%乙醇Ⅰ30秒95%乙醇Ⅱ30秒85%乙醇30秒75%乙醇30秒自来水洗2-3次(2)、染色：苏木素染液5-10分钟自来水洗2-3次1%盐酸酒精（80%酒精）分化15-60秒自来水洗2-3次碳酸锂饱和水溶液15-30秒自来水洗2-3次(3)、脱水、透明、封固：80%乙醇15-30秒95%乙醇Ⅰ15-30秒95%乙醇Ⅱ15-30秒无水乙醇Ⅰ15-30秒无水乙醇Ⅱ15-30秒二甲苯Ⅰ15-30秒二甲苯Ⅱ15-