病理检验技术

荧光原位杂交FISH用DNA探针与组织切片上互补的DNA杂交，通过观察荧光信号在染色体上的位置和颜色来反映相应基因的情况。第一章病理检验技术概述病理学的作用：1、研究疾病的病因、发病机制，认识疾病的发生发展规律2、为临床诊断疾病、治疗疾病、分析预后提供依据等。病理检验的定义：------在临床医疗实践中，通过对患者病变组织或细胞进行检查，以协助临床诊断疾病的方法称为病理检验。一、病理检验的主要任务（一）确定疾病的诊断（二）为临床选择治疗方案提供依据（三）提供有关预后因素的信息。（最正确、最可靠、最后的诊断）（四）了解疾病的发展及分析疗效（五）为科学研究积累资料（六）为提高临床诊断水平服务二、病理检验分类（一）细胞学检验（脱落细胞、细针穿刺吸取）（二）组织学检验---最后的诊断活体组织检验、手术标本检验、手术中病理检验（三）尸体剖验病理学技术：在病理学临床及科学研究工作中使用的各种技术方法统称为病理学技术。病理检验技术的质量和水平是临床病理诊断工作中至关重要的因素。“技术是病理学之母。”第二节、病理检验技术常规工作收发工作协助取材和尸体剖检工作制作制作切片及细胞学涂片病理资料管理及检索药品、物资的管理及仪器维护大体标本的收集和制作第六章组织制片技术P39常规石蜡切片制作程序组织固定→取材→固定→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→染色→封片→观察第一节组织块的处理（一）组织切片制作过程中的各种操作：1、取材与固定：合理取材、及时固定；2、洗涤、脱水、透明；4、浸蜡、包埋；5、切片、贴片（展片、捞片）和染色：6、封片：长期保存。一、取材：-------按照病理检查的目的和要求，切取适当大小和数量的组织块，用于制作组织切片的过程。注意事项：部位、大小、形状、方向二、固定和固定液固定：将组织浸入某些化学试剂，使组织细胞内的物质尽量保持在生活状态时的形态结构和位置过程。（一）固定目的：（1）防止组织、细胞的自溶与腐败；（2）凝固或沉淀细胞内物质；（3）增加组织硬度，便于制片；（4）产生不同的折光率，有利于染色后观察辨认。（二）固定方法：1、浸泡固定法：病理外检一般均用此法；2、注射、灌注法：体积过大或整个脏器或尸体的固定；3、微波固定法：应用于临床病理快速诊断，微波固定组织温度至关重要。微波固定介质可用生理盐水或10%甲醛。4、蒸汽固定法：为了固定组织中可溶性物质、血液、细胞涂片等；（三）固定液的特性：1、渗透力强，迅速渗入组织内部2、不会使组织过度收缩或膨胀3、能硬化组织，保持细胞形态和位置4、使组织对染料产生亲和力，产生折光率（四）组织固定注意事项：1、及时固定2、固定容器宜大3、固定液应足量：固定组织体积的10-20倍4、防止组织变形5、确定恰当的固定时间（五）组织固定液常用固定液：1、4%甲醛（福尔马林）：配置为市售的40%甲醛1份加水9份混合即成；2、酒精（乙醇）：高浓度组织硬化显著，先用80%固定数小时，再用95%固定；3、中性缓冲甲醛液：可提高免疫组化阳性率。4、酒精-甲醛液（A-F固定液）：5、Zenker固定液：1、4%甲醛（福尔马林）：久置能产生白色沉淀（三聚甲醛），容易氧化变成甲酸，严重影响细胞核着色。固定陈旧多血脏器如肝脾，易产生黑色色素，叫甲醛色素。2、酒精（乙醇）：高浓度组织硬化显著，先用80%固定数小时，再用95%固定；50%以上浓度的乙醇可溶解脂肪和类脂质，也可以溶解血色素和损害其他色素。中性甲醛液配置：40%甲醛150-200ml，蒸馏水800-850ml，磷酸二氢钠4g，磷酸氢二钠13g。常用的固定液或标本保存液，是免疫组化最常用的固定液。选择性固定液：1、丙酮：广泛用于组织化学中酶的固定；2、戊二醛固定液：广泛用于电镜标本的固定，应采用缓冲液配制固定液3、醋酸：不能保存糖，也不能固定脂肪及类脂，5%醋酸pH2～3可抑制细菌和酶的活性；4、苦味酸：强酸，易燃易爆，酒精溶液可固定糖类；5、氯化汞：只宜固定薄片组织，2mm～3mm厚的组织需固定6～18小时；6、重铬酸钾：固定高尔基体、线粒体，对酸性染料着色良好；7、锇酸：浓度为1%～2%水溶液用于电镜制片；骨组织脱钙液：在脱钙前，先将骨或钙化组织锯成4mm～5mm厚的簿片，按常规充分固定，然后进行脱钙。组织脱钙的方法及应用：（一）酸性溶液脱钙：1、脱钙液配制：（1）5%～10%硝酸水溶液：浓硝酸5ml～10ml，蒸馏水加至100ml；（2）硝酸甲醛液：浓硝酸10ml，10%福尔马林90ml；（3）Schridde液：浓硝酸20ml，10%福尔马林100ml。对组织无明显损害，迅速、安全；（4）5%～10%甲酸水溶液：甲酸5ml～10ml，蒸馏水加至100ml（5）甲酸酒精液：脱钙速度较硝酸慢，但破坏组织也轻。（6）Plank-Rychlo液：脱钙比5%硝酸液快3倍。Jenkins混合酸脱钙液、盐酸氯化钠液、枸橼酸钠、甲酸脱钙液等2、脱钙方法：骨片悬于脱钙液中，敞开瓶口，每日更换一次新液，最好早晚各一次。（二）螯合剂脱钙：速度很慢，但对组织成分几乎没有损害。用于免疫组化染色较理想。1、脱钙液配制：取乙二胺四乙酸二钠（EDTA）25g，溶解于200ml蒸馏水中，氢氧化钠（NaOH）调整pH至7.0（大约加2.5gNaOH）。EDTA与钙可形成一种可溶性非离子化的复合物。2、脱钙法：将骨片浸入脱钙液中，每周更换一次新液。一般致密骨脱钙需要6～8周，含有少量骨渣的组织约需一周。（三）电解脱钙法：此法即在脱钙液中通过电流，电解加速脱钙。1、电解脱钙液配制：25%盐酸50ml，25%甲酸200ml，蒸馏水750ml；2、脱钙方法：直径30cm电解槽内盛大量电解液，将骨组织放在一个四周多孔的塑料小容器内放入电解液内，此容器通入白金丝或钨丝作阳极，在电解液内再放一白金丝或钨丝作阴极，通入6V直流电，电流强度1A～2A，调节两电极的距离来控制。电解液温度不超30℃～45℃，一般2～6小时即可脱尽。脱钙后的处理1、脱钙后的组织经流水冲洗4～12小时，除去残留的脱钙剂；2、修去锯面的薄层组织，切成适当大小的组织块，进行常规脱水、透明、浸蜡及包埋；3、用酸性液脱钙后的组织，苏木素染色时间应适当延长，在伊红中的时间应该缩短；4、脱钙后组织切片在染色中较易脱落，充分烤片，染色前滴加2%～5%的火棉胶液，以使之粘贴牢固。三、洗涤、脱水、透明（一）组织的洗涤1、洗涤的目的：防止组织中留有较多的固定液而影响脱水剂；2、洗涤的方法：（1）固定剂以水配制者：常用的固定剂是甲醛溶液（10%福尔马林溶液），用流水冲洗。大组织冲洗24小时，小组织冲洗2～4小时。（2）固定剂含酒精者：一般不用冲洗，如需要冲洗必须用与固定剂中的酒精浓度相近或略低的酒精冲洗。（二）组织脱水1、脱水的目的及原则：用某些溶剂逐渐将组织内吸收的水分置换出来，以利于透明剂和石蜡或火棉胶的渗入。2、脱水剂的种类及特征：特征：能与水在任何比例下混合；能与透明剂在任何比例下混合；单纯脱水剂：脱水后再经二甲苯透明才浸蜡；酒精：最常见的脱水剂。脱水能力强，但易使组织收缩、脆。单纯脱水剂：脱水后再经二甲苯透明才浸蜡；丙酮：脱水强，组织收缩严重，价格高。异丙醇：可代替无水酒精使用。价格贵。脱水兼透明剂：脱水后即可直接浸蜡。正丁醇：为脱水剂兼有透明剂作用。用于植物标本的处理效果较好。叔丁醇：脱水兼透明。电镜标本制作时常用作中间脱水剂。（三）组织透明或媒浸目的是使石蜡能浸入组织块便于包埋。1、二甲苯：最常用的透明剂，有毒、易挥发，透明力强，但组织易收缩变脆，小块组织以30分钟。2、苯和甲苯：组织收缩小、不易变脆。3、氯仿：即三氯甲烷。易发挥，透明力比二甲苯差，时间长，多用于大块组织的透明。4、香柏油：为柏树树脂，收缩小，透明时间长，常用于染色后切片的透明。四、组织浸蜡（透蜡）P48（一）浸蜡的目的和方法：除去组织中的透明剂而代之以石蜡，以便切片。（二）浸蜡剂的种类：1、石蜡：经56℃～58℃石蜡浸蜡的组织包埋，有利于组织切片的连续性，对蜡块资料保存可靠，一般为3-4小时。2、火棉胶：目前使用火棉胶浸入组织较少，多用于染色前的覆盖液。3、碳蜡；4、明胶。五、组织包埋P49（一）石蜡包埋法：为最常用的包埋法。1、常规石蜡包埋法:包埋过程、包埋面的选择；2、体液标本一般不做包埋和切片。（二）快速石蜡包埋法：1、操作过程：全程均加热，20～30分钟完成。（1）取材、固定：薄片1cmⅹ0.5cmⅹ0.3cm,在快速固定液（95%酒精、40%甲醛、冰醋酸）内加热煮沸1～2分钟。（2）脱水：组织厚度不超1.5mm，加入丙酮5～8ml，煮沸5～6分钟。（3）透明：加二甲苯加热1～2分钟。（4）包埋：石蜡包埋冰水冷却硬化。3、碳蜡包埋法：即聚乙烯二醇。包埋熔点为38℃和52℃左右的分子量为1500和4000两种。适用于脂肪及脂类组织的制片。4、明胶包埋法：5、石蜡半薄切片包埋法：常根据组织类型进行脱水、透明和浸蜡。6、树脂包埋法：适用于不脱钙骨髓活检组织、肝、肾穿刺活检和淋巴结组织等。第二节切片器具与切片一、切片机：制作组织切片的主要仪器设备。（一）切片机的种类及使用：1、石蜡切片机：能将石蜡包埋的组织切出一定厚薄的切片。分为旋转式、滑动式、摆动式等。最常用的为旋转式。2、冷冻切片机：多为恒冷箱切片机用于组织化学、免疫组化及病理诊断。3、火棉胶切片机：多用于眼球、内耳、脊髓和脑的切片，切片厚度可达20µm～50µ。二、组织切片刀P58（一）切片刀的种类：其长度一般有4cm、8cm、14cm、18cm、20cm、24cm等。1、平凹型：一侧为直线，另一侧为凹度，大凹度刀适用于火棉胶切片，小凹度刀适于石蜡切片。2、双平型：刀身两侧均无凹度，两面是平面。适用于冷冻切片和轮转式切片机的石蜡切片。3、双凹型：刀身两侧均有凹度，适用于轮转式石蜡切片。4、一次性刀片：需配置专用刀架。（二）刀背套与刀柄：刀背套供磨刀时用，刀背套有金属和塑料两种。刀柄有木制及塑料制两种。（三）磨刀与被刀：1、手工磨刀法：①磨刀前用软布试净磨刀石面尘垢；②装上刀背和刀柄，滴磨刀油于磨刀石上；③右手紧握刀柄，左手紧按刀背另一端，刀刃向前，逐渐推动刀片至磨刀的一端，从右到左全部磨完。2、被刀：用被刀皮革被刀，与磨刀的动作相反；三、石蜡切片制作P60（一）切片前的准备：修整蜡块，然后置于冷水或冰箱中冷却，以增加硬度；准备毛笔、眼科弯镊子；载玻片均匀涂上薄层蛋清甘油，占2/3；接通摊片机电源，调节摊片（42℃～48℃）烤片（60-70℃左右）的温度；（二）快速石蜡切片P63快速石蜡切片时，组织取材应薄，厚度一般不超过2mm，组织固定后要重新修正至1.5mm左右厚度，以利脱水，将组织块埋入预制的蜡块内，冷却硬化后方可切片（取材、脱水、透明浸蜡、包埋见）。切片捞至载波片上，用酒精灯略加烘烤，再入二甲苯脱蜡，经95%酒精后即刻入水水化，随后即可进行常规快速苏木素伊红染色。（三）冷冻切片制作P64组织经过冷冻后，其内的水分结冰，使组织变硬，有利于切成薄片。一、设备要求：（一）冷冻切片机：一般由转轮式切片机或推拉式切片机加上制冷装置而成：1、二氧化碳制冷器；2、半导体制冷器；（二）恒冷箱冷冻却片机：利用压缩机通过制冷剂循环制冷。冰冻切片机二、制作过程（一）取材、固定：选取有代表性的组织制片，厚度1～2mm。一般病理急诊、组织化学显示酶和免疫病理学进行荧光抗体研究等，多数都用新鲜组织直接冷冻，切片后再进行固定、染色或直接染色或孵化。采用二氧化碳冷冻设备制作须先固定。（二）冷冻切片方法：1、恒温箱冷冻切片法（1）开机预冷：切片前2～3小时，所需温度如下：各种新鲜组织冷冻切片参考温度（℃）脑、淋巴结、肝、肾、脾、睾丸-12--16肌肉、肾上腺、甲状腺、子宫、卵巢-18--22乳腺、皮肤、前列腺-22--28（2）放入、速冻、修整组织，待恒冷箱内温度降至要求温度后，将组织用OT包埋，再速冻1～2分钟，装于机样本夹上，修平；（3）调节抗卷板，以与刀刃平行对齐；（4）切片：所需厚度为4µm～8µm，用毛笔展平，贴于