第十节谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力测定

1.3.6.2血或组织中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－Px）活力测定1.3.6.2.1原理谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）是体内存在的一种含硒清除自由基和抑制自由基反应的系统。对防止体内自由基引起膜脂质过氧化特别重要，其活力以催化GSH氧化的反应速度，及单位时间内GSH减少的量来表示，GSH和5,5’-二硫对硝基苯甲酸（DTNB）反应在GSH-Px催化下可生成黄色的5-硫代2-硝基苯甲酸阴离子，于423nm波长有最大吸收峰，测定该离子浓度，即可计算出GSH减少的量，由于GSH能进行非酶反应氧化，所以最后计算酶活力时，必须扣除非酶反应所引起的GSH减少。1.3.6.2.2试剂和仪器仪器：可见光分光光度计、酶标仪、低温高速离心机、匀浆器、恒温水浴锅、微量加样器试剂：叠氮钠磷酸缓冲液pH7.0NaN316.25mg终浓度2.5mmol/LEDTA-Na27.44mg终浓度0.2mmol/LNa2HPO41.732g终浓度0.2mol/LNaH2PO41.076g终浓度0.2mol/L加蒸馏水至100mL，用少量HCL、NaOH调pH7.0，4℃保存。1mmol/L谷胱甘肽（还原型GSH）溶液GSH30.7mg加叠氮钠磷酸缓冲液至100mL，临用前配制，冰冻保存1－2日。1.25－1.5mmol/LH2O2溶液取30％H2O20.15－0.17mL，用双蒸水稀释至100mL，作为贮备液，4℃避光保存，临用前将贮备液用双蒸水稀释10倍即可。偏磷酸沉淀液HPO316.7g（先用蒸馏水溶解）EDTA0.5gNaCl280g加蒸馏水至1000mL，用普通滤纸过滤，室温保存。0.32mol/LNa2HPO4溶液:Na2HPO422.7g加蒸馏水至500mL，室温保存。DTNB显色液DTNB40mg柠檬酸三钠1.0g加蒸馏水至100mL，4℃避光保存1个月。0.2M磷酸缓冲液pH7.40.9%生理盐水1.3.6.2.3实验步骤1.3.6.2.3.1样品制备溶血液：取鼠血10μl加入到1mL双蒸水中，充分振摇，使之全部溶血1:100待测，4h内测定酶活力。若当天来不及测定，将肝素抗凝全血置-20℃冻存，3d内测定，若4℃存放，28h内必须测完。测前取出样品室温自然解冻。组织上清液：动物禁食过夜，处死后，立即取出所需脏器，放入冷生理盐水中洗去浮血，剔除脂肪及结缔组织，滤纸吸干后，在冰浴上剪成碎块，称取适量组织，加冷0.2M磷酸缓冲液，以20000r/min匀浆10s，间歇30s，反复3次制成5%组织匀浆，操作在冰浴中进行，匀浆以12500×g离心10min（低温高速离心机），以沉淀为破碎的细胞、细胞碎片、核及线粒体，上清液用以测胞液中的酶活力，最好当天测，否则加20％（v/v）甘油分装于塑料管，放置-20－-80℃，可保存数周，而酶活力不减。1.3.6.2.3.2GSH标准曲线的制作：取1.0mmol/LGSH溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别置于10mL小容器瓶中，各加入偏磷酸沉淀剂8mL，用双蒸水稀释至10mL刻度，即得到浓度为0、20、40、60、80、100μmol/L的GSH标准液。取上述不同浓度标准液各2mL，放入试管中，加入0.32mol/LNa2HPO42.5mL，比色前加入DTNB显色液0.5mL用光径1cm杯，5min内在可见光423nm波长测OD值，以双蒸水调零点。以GSH含量（μmol/L）为横坐标，OD423值为纵坐标，绘制标准曲线。1.3.6.2.3.3测定步骤：试剂样品管（mL）非酶管（mL）空白管（mL）1.0mmol/LGSH0.40.4样品**0.4双蒸水*0.437℃水浴预温5minH2O2（37℃预热）0.20.237℃水浴准确反应3min（严格控制时间）偏磷酸沉淀液443000r/min离心10min离心上清液22双蒸水0.4偏磷酸沉淀液1.60.32mol/LNa2HPO42.52.52.5DTNB显色液0.50.50.5显色反应1min后于423nm波长（1cm光径），读OD值，5min之内读数准确。*样品为组织上清液时，非酶管改为加热使酶失活的组织上清液。**溶血液0.1－0.4mL组织上清液1:20稀释，取稀释液0.4mL注：如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行。1.3.6.2.3.4计算鼠全血GSH-Px活力单位规定每1mL全血，每分钟，扣除非酶反应的log[GSH]降低后，使log[GSH]降低1为一个酶活力单位。非酶管log[GSH]-样品管log[GSH]鼠全血GSH-Px活力单位（U/mL全血）=────────────────3min×0.004mLlog[非酶管OD－空白管OD]-log[样品管OD-空白管OD]=────────────────────────3min×0.004mL组织GSH-Px比活力单位规定每毫克蛋白质，每分钟，扣除非酶反应，使GSH浓度降低1μmol/L为一个酶活力单位。（非酶管OD－样品管OD）×A**×5组织GSH-Px比活力单位（U/mg蛋白）=───────────────────3min×样品蛋白质的mg数**Folin法或双缩脲法测样品蛋白质含量标准GSH浓度（μmol/L）**A=───────────即标准曲线斜率。标准GSH光密度（OD）1.3.6.2.4注意事项1.3.6.2.4.1由于H2O2易分解导致浓度改变，临用时取贮备液用分光光度计测其浓度，取贮备液3mL，测定1cm光径的240nm处OD值。OD浓度（mmol/L）＝————————0.036（消光系数）若OD值为0.45，则表明H2O2浓度为12.5mmol/L。1.3.6.2.4.25-硫代2-硝基苯甲酸阴离子的显色不仅与整个反应体系中氢离子浓度有关，还受反应时间限制。加入显色剂后，反应体系pH为6.5时，11min开始显色，此时比色5min内读数准确。1.3.7抗氧化物质还原型谷胱甘肽（GSH）测定谷胱甘肽是一种低分子清除剂，它可清除O2-、H2O2、LOOH。谷胱甘肽是谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸组成的一种三肽，是组织中主要的非蛋白质的巯基化合物，是GSH-PX和GST两种酶类的底物，为这两种酶分解氢过氧化物所必需，它能稳定含巯基的酶，和防止血红蛋白及其它辅助因子受氧化损伤，缺乏或耗竭GSH会促使许多化学物质或环境因素产生中毒作用，GSH量的多少是衡量机体抗氧化能力大小的重要因素。1.3.7.1血或组织中还原型谷胱甘肽（GSH）测定方法1.3.7.1.1原理GSH-和5，5'-二硫对硝基甲酸（DTNB）反应在GSH-Px催化下可生成黄色的5-硫代2-硝基甲酸阴离子，于420nm波长有最吸收峰，测定该离子浓度，即可计算GSH的含量。1.3.7.1.2仪器和试剂仪器：可见光分光光度计、酶标仪、低温高速离心机、匀浆器、恒温水浴锅、微量加样器试剂：0.9％生理盐水4％磺基水杨酸溶液0.1mol/LPBS溶液（pH=8.0）：称取Na2HPO413.452g，KH2PO40.722g，加蒸馏水至1000mL。0.004％DTNB溶液：称取DTNB40mg溶于1000mL的0.1mol/LPBS溶液（pH=8.0）中。叠氮纳缓冲液：NaN316.25mgEDTA-Na27.44mgNa2HPO41.732gNaH2PO41.076g加蒸馏水至1000mL，用少量HCl、NaOH调pH7.0，4℃保存。标准溶液：称取还原型GSH15.4mg，加叠氮纳缓冲液至50mL，终浓度为1mmol/L，临用前配制。1.3.7.1.3实验步骤1.3.7.1.3.1样品制备：溶血液上清液：取0.1mL抗凝全血加双蒸水0.9mL（1：9溶血液），充分混匀，直至透亮为止。取溶血液0.5mL加4%磺基水杨酸0.5mL混匀，室温下3500rpm离心10分钟，取上清液备用。血清上清液：取0.1mL血清加4%磺基水杨酸0.1mL混匀，室温下3500rpm离心10分钟，取上清液备用。组织上清液：取组织0.5g加生理盐水4.5mL充分研磨成细浆（10%肝匀浆），混匀后取浆液0.5mL加4%磺基水杨酸0.5mL混匀，室温下3500rpm离心10分钟，取上清液备用。1.3.7.1.3.2样品测定：溶血液或组织样品测定：测定管空白管上清液0.5mL－4%磺基水杨酸－0.5mLDTNB4.5mL4.5mL混匀，室温放置10分钟后，420nm处测定吸光度。血清样品测定：测定管空白管上清液0.1mL－4%磺基水杨酸－0.1mLDTNB0.9mL0.9mL混匀，室温放置10分钟后，420nm处测定吸光度。注：该指标检测，需新鲜样品取材后当天完成。用双缩脲法测定血清（或溶血液）、组织匀浆蛋白质含量。如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行。1.3.7.1.3.3标准曲线取1mmol/LGSH标准溶液0、10、20、50、100、150、200µL,分别加入生理盐水至0.5mL，即得到0、20、40、100、200、300、400µmol/L的GSH标准液系列，各管加入DTNB4.5mL，混匀，室温放置10分钟后，空白管调零，420nm处测定吸光度。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，做标准曲线。12345671mmol/LGSH（mL）00.010.020.050.100.150.20生理盐水（mL）0.500.490.480.450.400.350.30DTNB（mL）4.504.504.504.504.504.504.50GSH量（mol/L）020401002003004001.3.7.1.3.4计算样品GSH含量=对应曲线浓度值（mol/L）×溶血液稀释倍数×上清液稀释倍数（mol/L全血）=对应曲线浓度值（mol/L）×10×2样品GSH含量=对应曲线浓度值（mol/L）×上清液稀释倍数（mol/L血清）=对应曲线浓度值（mol/L）×2样品GSH含量=对应曲线浓度值（mol/L）×上清液稀释倍数÷上清液组织含量（mol/g组织）=对应曲线浓度值（mol/L）×2÷100g组织/L样品GSH含量=对应曲线浓度值（mol/L）×上清液稀释倍数÷上清液蛋白含量（mol/gprot）=对应曲线浓度值（mol/L）×2÷匀浆gprot/L1.4数据处理与结果判定1.4.1数据处理一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。1.4.2指标判定1.4.2.1脂质氧化产物受试样品组与模型（或老龄）对照组比较，过氧化脂质（丙二醛或8-表氢氧异前列腺素）含量降低有统计学意义，判定该受试样品有降低脂质过氧化作用，该项指标结果阳性。1.4.2.2蛋白质氧化产物受试样品组与模型（或老龄）对照组比较，蛋白质羰基含量降低有统计学意义，判定该受试样品有降低蛋白质过氧化作用，该项指标结果阳性。1.4.2.3抗氧化酶活力受试样品组与模型（或老龄）对照组比较，抗氧化酶（SOD或GSH-PX）活力升高有统计学意义，判定该受试样品有升高抗氧化酶活力作用，该项指标结果阳性。1.4.2.4抗氧化物质GSH受试样品组与模型（或老龄）对照组比较，GSH含量升高有统计学意义，判定该受试样品有升高抗氧化物质GSH作用，该项指标结果阳性。1.4.3结果判定过氧化脂质含量、蛋白质羰基、抗氧化酶活性、还原性谷胱甘肽四项指标中三项指标阳性，可判定该受试样品抗氧化动物实验结果阳性。