矿质元素对植物的作用(2013级).

综合实验3矿质元素对植物的作用一、实验教学目的掌握植物体内硝态氮、硝酸还原酶活性的测定方法；比较不同条件(N素、光照、还原糖等)对硝酸还原酶的诱导作用。综合实验3矿质元素对植物的作用二、实验意义(一）硝酸还原酶活性的测定硝酸还原酶(NR)是硝酸盐同化中第一个酶，也是限速酶，处于植物氮代谢的关键位置。它与植物吸收利用氮肥有关，对农作物产量和品质有重要影响，因而硝酸还原酶活性被当作植物营养或农田施肥的指标之一，也可作为品种选育的指标之一。综合实验3矿质元素对植物的作用二、实验意义（二）植物体内硝态氮含量的测定1、植物体内硝态氮含量可反映土壤氮素供应情况，常作为施肥指标。2、蔬菜类作物特别是叶菜和根菜中常含有大量硝酸盐，在烹调和腌制中可转化为亚硝酸盐而危害健康，故硝酸盐含量又成为蔬菜及其加工品的重要品质指标。综合实验3矿质元素对植物的作用三、实验基本原理(一）硝酸还原酶活性的测定硝酸还原酶是一种诱导酶，受到NO3-的诱导，在未供应NO3-之前，细胞中不存在已合成的硝酸还原酶，也找不到编码这种蛋白的mRNA。当供给NO3-数小时后，即有硝酸还原酶的合成。此外，光照、还原性糖以及叶绿体正常功能等也是诱导植物NRmRNA基因表达的重要影响因素。综合实验1矿质元素对植物的作用三、实验基本原理(一）硝酸还原酶活性的测定采用真空渗入法使NO3-进入植物组织，并在硝酸还原酶作用下还原为NO2-，产生的亚硝态氮在酸性溶液中与对-氨基苯磺酸形成重氮盐，再与α-萘胺定量生成红色偶氮化合物，生成的红色偶氮化合物在520nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。NO3－+NADH+H+——→NO2－+NAD++H2ONRase综合实验3矿质元素对植物的作用三、实验基本原理（一）硝酸还原酶活性的测定综合实验3矿质元素对植物的作用三、实验基本原理（二）植物体内硝态氮含量的测定在酸性条件下，NO3-与水杨酸反应，生成硝基水杨酸，生成的硝基水杨酸在碱性条件下（pH＞12）呈黄色，最大吸收波长为410nm，在一定范围内，其颜色的深浅与含量成正比，可直接比色测定。该方法测定硝态氮含量十分稳定可靠。综合实验3矿质元素对植物的作用四、仪器试剂（一）硝酸还原酶活性的测定（309实验室）1、实验组玻璃仪器：(1)50ml三角瓶4个(2)试管4根(3)打孔器2个(4)玻棒2根(5)移液管7根试剂：(1)PH7.5磷酸缓冲液(2)0.2molKNO3(3)1%(w/v)磺胺(4)1%(w/v)α-萘胺(5)蒸馏水综合实验3矿质元素对植物的作用四、仪器试剂（一）硝酸还原酶活性的测定（309实验室）2、标准曲线组玻璃仪器：(1)试管7根(2)移液管5根试剂：(1)1%(w/v)磺胺(2)1%(w/v)α-萘胺(3)蒸馏水(4)5ug/mlNaNO2综合实验3矿质元素对植物的作用四、仪器试剂（二）植物体内硝态氮含量的测定（310实验室）1、实验组玻璃仪器：(1)试管4根(2)烧杯和漓管(3)25ml容量瓶2个(4)漏斗2个(5)弯颈漏斗2个(6)玻棒2根(7)移液管5根试剂：(1)5%水杨酸－硫酸溶液(2)8%NaOH水溶液(3)蒸馏水综合实验3矿质元素对植物的作用四、仪器试剂（二）植物体内硝态氮含量的测定（310实验室）2、标准曲线组玻璃仪器：(1)50ml容量瓶8个(2)试管9根(3)移液管8根试剂：(1)5%水杨酸－硫酸溶液(2)8%NaOH水溶液(3)蒸馏水(4)500mg／LKNO3综合实验3矿质元素对植物的作用五、实验材料1、水稻、小麦、玉米、大豆、棉花、蓖麻、烟草、向日葵等农作物叶片及地下部；2、黄瓜、茄子、辣椒、豆角、大白菜、萝卜等蔬菜绿叶、心叶、菜心、菜帮、地下部等；3、八仙花、红叶石楠、大叶黄杨、海桐、木芙蓉、紫荆、珊瑚树等园林植物叶片；4、枫香、木荷、梧桐、泡桐等林木叶片。综合实验3矿质元素对植物的作用六、实验设计1、比较不同N素形式(NO3-、NH4+、尿素)对NR活性的诱导作用及植物体内硝态氮含量的影响；2、探讨光照、温度、pH对NR活性的影响；3、不同种类还原糖对NR活性的影响；4、不同植物NR活性及硝态氮含量的差异；5、同一植物不同器官或不同生长时期NR活性及硝态氮含量的差异；6、探讨不同土壤条件下硝态氮含量的差异。管号1234567亚硝酸钠标准液（ml）00.10.20.40.60.81.0蒸馏水（ml）1.00.90.80.60.40.201％对－氨基苯磺酸（ml）22222220.2%α-萘胺（ml）2222222每管含NO2-(ug)00.10.20.40.60.81.0七、实验步骤（一）硝酸还原酶活性的测定1.标准曲线制作取1mlNaNO2标准液(空白用H2O)→→2ml磺胺试剂→2mlα-萘胺试剂摇匀，室温静置30min→520nm比色标准溶液显色情况综合实验3矿质元素对植物的作用（2013年5月14上午）亚硝态氮含量标准曲线y=2.7008x+0.006R2=0.996400.511.522.500.20.40.60.8消光值亚硝态氮含量（ug）综合实验3矿质元素对植物的作用（2013年5月15日下午）亚硝态氮标准曲线y=2.7365x-0.0119R2=0.9993-0.500.511.522.500.20.40.60.8消光值亚硝态氮含量（ug)5ml磷酸缓冲液5mlH2O5mlKNO3称量0.3～0.5g等重材料2份分别置于三角瓶①、②三角瓶①、②置于干燥器，真空抽气①②30℃恒温箱中黑暗保温30min取反应液1ml+2ml磺胺试剂+2mlα-萘胺试剂①②摇匀，室温静置显色30min520nm比色、查标准曲线、计算放气后摇晃材料下沉注意加液顺序硝酸还原酶活性测定操作过程管号12345678硝酸钾标准液（ml)1234681012蒸馏水（ml)4948474644424038每管硝酸氮含量(ug/ml)102030406080100120七、实验步骤（二）植物体内硝态氮含量的测定1.标准曲线制作取0.1mlKNO3标准液(空白用H2O)→→0.4ml5%水杨酸-硫酸→摇匀，室温下静置20min加8%NaOH溶液9.5ml，摇匀冷却→410nm比色标准溶液显色情况综合实验3矿质元素对植物的作用(2013年5月14日)硝态氮标准曲线y=0.005x+0.0004R2=0.975800.10.20.30.40.50.60.7020406080100120140硝态氮含量消光值综合实验3矿质元素对植物的作用(2013年5月14日下午）硝态氮标准曲线y=168.56x-4.1568R2=0.9887-2002040608010012014000.20.40.60.8消光度硝态氮浓度（ug/ml)综合实验3矿质元素对植物的作用(2013年5月15日下午）硝态氮标准曲线y=154.67x+4.2625R2=0.994302040608010012014000.20.40.60.81消光值硝态氮含量(ug/ml)精确称取剪细、混匀植物材料，每份1.0～2.0g放入试管，加去离子水10ml，弯颈漏斗封口沸水浴中提取30min，自来水冷却过滤到25ml容量瓶，去离子水冲洗残渣，定容取试管1支，加0.1ml样品液加5%水杨酸-硫酸0.4ml，摇匀，室温静置20min加8%NaOH溶液9.5ml，摇匀冷却410nm比色，查标准曲线溶液加到试管底部，以免影响结果用强酸、强碱注意安全，如外溅，立即用水冲洗和擦洗硝态氮含量测定操作过程（一）硝酸还原酶活性的测定硝酸还原酶活性(μg·g-1·h-1)﹦（②N02-含量-①N02-含量）×10/W×t其中：②NO2-含量为反应液②中亚硝态氮含量(ug)；①NO2-含量为反应液①中亚硝态氮含量(ug)；W为样品重量(g)；t为反应时间(h)。八、结果与分析（二）植物体内硝态氮含量的测定硝态氮含量(mg·g-1FW)=(C×V)/W其中:C为标准方程计算得NO3-－N浓度(ug·ml)；V为提取样品液总量(ml)；W为样品鲜重(g)。八、结果与分析综合实验3矿质元素对植物的作用九、注意事项（一）硝酸还原酶活性的测定1、该酶为诱导酶，可于实验前一两天，用硝酸盐进行叶面喷施以增强其活性。取回材料后注意冲洗叶片上残留的硝酸盐。2、取样前材料应照光3h以上，大田取样在上午9点后为宜，阴雨天不宜取样。取样部位应尽量一致。3、硝酸盐还原过程应在黑暗中进行，以防止亚硝酸盐还原为氨。。4、显色到比色时间要一致，过短过长对影响颜色。综合实验3矿质元素对植物的作用九、注意事项（二）植物体内硝态氮含量的测定1、分光光度计、比色杯用水冲洗，擦镜纸擦净；比色杯倒液不超2/3；用完后及时洗净!2、实验操作中用强酸、强碱注意安全，如外溅，立即用水冲洗和擦洗!3、测定结束后，将试管彻底洗刷干净(因含强碱)，倒置在试管架上!实验结束要求各组用品洗刷干净，玻璃仪器及药品摆放整齐、齐全之后报告老师或班长（同时实验报告上交学习委员），经检查同意可离去。值日生请负责：维护分光光度计、比色皿擦洗台面扫地、拖地