硫酸铵分级沉淀原理及实验方案

一，基本原理硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白变性而应用最为广范。二，试剂及仪器1.组织培养上清液、血清样品或腹水等2.硫酸铵（NH4）SO43.饱和硫酸铵溶液（SAS）4.蒸馏水5.PBS(含0.2g/L叠氮钠)6.透析袋7.超速离心机8.pH计9.磁力搅拌器三，操作步骤以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33%—50%。（一）配制饱和硫酸铵溶液（SAS）1.将767g（NH4）2SO4边搅拌边慢慢加到1升蒸馏水中。用氨水或硫酸调到硫酸pH7.0。此即饱和度为100%的硫酸铵溶液（4.1mol/L,25°C）.2.其它不同饱和度铵溶液的配制（二）沉淀1.样品（如腹水）20000′g离心30min，除去细胞碎片；2.保留上清液并测量体积；3.边搅拌边慢慢加入等体积的SAS到上清液中，终浓度为1：1（4.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或搅拌过夜（4°C），使蛋白质充分沉淀。（三）透析1.蛋白质溶液10000′g离心30min（4°C）。弃上清保留沉淀；2.将沉淀溶于少量（10-20ml）PBS-0.2g/L叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对PBS-0.2g/L叠氮钠透析24-48小时（4°C），每隔3-6小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨；3.透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。四，应用提示（一）先用较低浓度的硫酸氨预沉淀，除去样品中的杂蛋白。1.边搅拌边慢慢加SAS到样品溶液中，使浓度为0.5:1(v/v)；2.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或过夜（4°C）；3.3000′g离心30min（4°C），保留上清液；上清液再加SAS到0.5:1(v/v)，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于PBS，同前透析，除去硫酸氨；4.上清液再加SAS到0.5:1(v/v)，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于PBS，同前透析，除去硫酸氨；5.杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时，用预沉淀除杂蛋白是非常有效（二）为避免体积过大，可用固体硫酸氨进行盐析（硫酸氨用量参考表1）；硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用，可得到更进一步纯化的抗体。今天作的实验是利用硫酸铵沉淀蛋白质，从之前作过的经验知道，这一个步骤是有名的烦，要慢慢用敲的把硫酸铵缓缓的加入蛋白质溶液中。相关的原理可以在庄荣辉学习网站中找到，与盐溶刚好相反，在蛋白质溶液中加入硫酸铵，会使得蛋白质的溶解度下降，因而沉淀出来。因为硫酸铵所解离的离子容很大，所带的电子数也多(NH4+,SO42-)，因此当其溶入水中时，会吸引大量水分子与这些离子水合。蛋白质分子表面多少有一些较不具极性的区域，水分子会在这些非极性区的表面聚集，形成类似『水笼』的构造(请见下图)，以便把蛋白质溶入水中。一旦蛋白质溶液加入硫酸铵，后者吸引了大量水分子，使水笼无法有效隔离蛋白质的非极性区，造成这些非极性区之间的吸引，因而沉淀下来。因此，分子表面上若有越多的非极性区域，就越容易用硫酸铵沉淀下来。在计算所添加的硫酸铵的重量方面，找到了一个不错的网站——硫酸铵计算机这个网页上可以靠着输入实验温度、溶液体积、想要到达的百分浓度以及初始的百分浓度这四个数值，就可以得到需要添加的硫酸铵克数，以及在加入固体硫酸铵后所增加的体积，算是一个很不错的网站。此外另一个比较值得提的，是我有用两种方式加入硫酸铵，第一种是固体的硫酸铵模碎加入，另一种是将硫酸铵溶成饱和溶液再加入，各有各的优缺点，比较如下：1.造成蛋白质变质的程度：固体的硫酸铵硫酸铵饱和溶液利用硫酸铵饱和溶液真的超棒，滴入的速度可以很快而不造成变质(没试过用倒入的)。不像固体的硫酸铵只能磨碎慢慢加入，速度一快蛋白质就坏了(溶液有致密的白色气泡产生)。2.操作的容易度：硫酸铵饱和溶液固体的硫酸铵固体硫酸铵最大的缺点就是操作不容易，要一直敲敲敲又不能太快，所以当你要溶解的蛋白质很多时，这是很累的步骤。然而硫酸铵饱和溶液比较麻烦只有在配制部分，要先加热让它饱合后，回到操作温度让它过饱和，最后用滤纸把硫酸铵结晶去掉。3.蛋白质溶液的体积放大程度硫酸铵饱和溶液固体的硫酸铵这是使用硫酸铵饱和溶液最头痛的部分，举例来说，要让100ml的硫酸铵百分比从0%到25%，如果是加入固体的硫酸铵，只会让溶液从100ml变成107ml左右，但若是加入硫酸铵饱和溶液，会让溶液变成125ml！而且若是要提高到50%，须加等量的硫酸铵饱和溶液，所以会让蛋白质溶液从100ml变成200ml。因此在加入硫酸铵时，若是低百分浓度可以利用硫酸铵饱和溶液，然而如果是高百分浓度的，除非不在意蛋白质溶液体积的放大(反正都要离心离下来)，否则还是用固体硫酸铵来的好。所以今天从0%拉到25%及从25%拉到50%时，都是利用硫酸铵饱和溶液，但是当要从50%拉到75%时，我选择利用固体硫酸铵，因为如果用硫酸铵饱和溶液，离心机无法离那么多的溶液体积。