第三章酶的提取与分离纯化

Chapter3酶的提取与分离纯化Section1细胞破碎一、机械破碎法1、研磨法2、捣碎法3、匀浆法二、物理破碎法1、渗透压破碎法2、冻融破碎法3、超声波破碎法三、化学破碎法常用的化学试剂有：1、表面活性剂：如十二烷基硫酸钠、土温（Tween）、特里顿（Triton）等。2、有机试剂：如甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等。3、螯和剂：如乙二胺四乙酸等。四、酶促破碎法1、外加酶处理2、自溶法Section2酶的提取一、酶提取的方法：1、盐溶液提取：盐的浓度一般控制在0.02～0.5mol／L。2、酸溶液提取：胰蛋白酶可用0.12mol／L的硫酸溶液提取。3、碱溶液提取：细菌L-天冬酰胺酶可用pH11～12.5的碱溶液提取。4、有机溶剂提取：如90%苯酚等。二、影响酶提取的主要因素：1、温度2、pH值3、提取液的体积4、添加保护剂5、溶解度6、扩散速度Section3沉淀分离一、盐析沉淀法二、复合沉淀法：常用的复合沉淀剂有单宁、聚乙二醇、聚丙烯酸等高分子聚合物。三、等电点沉淀法四、有机溶剂沉淀法五、热处理沉淀法Section4层析分离一、吸附层析：常用吸附剂包括：硅胶、活性炭、磷酸钙、碳酸盐、氧化铝、硅藻土、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖、琼脂糖等。二、离子交换层析：①装柱；②上柱；③洗脱与收集；④再生三、凝胶层析：凝胶层析又称为凝胶过滤、分子排阻层析、分子筛层析等。四、亲和层析五、高效液相层析（HPLC）六、分配层析1、纸上层析2、薄层层析Section5电泳分离一、纸电泳二、薄层电泳：常用的支持体有淀粉、纤维素、硅胶、琼脂等。三、薄膜电泳四、凝胶电泳1、聚丙烯酰胺凝胶的制备2、聚丙烯酰胺凝胶的分类①连续凝胶电泳②不连续凝胶电泳③梯度凝胶电泳④SDS-凝胶电泳五、等电点聚胶电泳1、两性电解质载体2、稳定pH梯度的形成3、支持pH梯度的介质①梯度溶液②凝胶4、操作过程①pH梯度支持介质的制备②电泳③分离组分的检测Section6离心分离一、离心机的选择1、常速离心机：最大转速在8000r／min以内。2、高速离心机：最大转速为(1～2.5)×104r／min。3、超速离心机：最大转速达(2．5～12)x104r／min。二、离心方法的选用1、差速离心2、密度梯度离心3、等密度梯度离心三、离心条件的确定1、离心力2、离心时间3、温度和pH值Section7过滤与膜分离一、非膜过滤1、粗滤：直径大于2μm的大颗粒。2、微滤：直径为0.2～2μm物质颗粒二、膜分离技术1、加压膜分离2、电场膜分裂3、扩散膜分离Section8萃取分离一、有机溶剂萃取二、双水相萃取1、双水相的形成2、影响物质分配平衡的因素三、超临界萃取四、反胶束萃取Section9结晶一、盐析结晶法二、有机溶剂结晶法三、透析平衡结晶法四、等电点结晶法Section10浓缩与干燥一、浓缩二、干燥1、真空干燥2、冷冻干燥3、喷雾干燥4、气流干燥5、吸附干燥