第九章病原真菌学技术研究进展(顾菊林)

1第九章病原真菌学技术研究进展第一节常用分子生物学技术分子生物学技术作为一种手段已广泛应用于感染性疾病的各个方面。它从上世纪50年代起步，经历了20多年的徘徊，到70年代以后，由于DNA重组技术、DNA合成与序列测定等技术的涌现及发展，促使该技术进入了一个全面发展的时代。目前所采用的技术手段主要有以下几种。一、分子杂交分子杂交技术其基本原理是根据两条同源单链核酸在一定的条件下（适宜的温度和离子浓度）发生按碱基配对形成双链的原理，通过将标记的核酸作为探针，与待测标本核酸进行杂交反应，即可观察到标本中核酸中相应的基因。用于检测的已知核酸片段叫做探针，为了便于示踪，必须将探针用一定的手段加以标记，以利于以后的检测。常用的标记物为放射性核素和非放射性核素如生物素、荧光素、抗原及抗体等。1．斑点杂交系将样品DNA/RNA直接点在固相支持物（如硝酸纤维膜）上，然后用标记探针杂交检测，它的特点是简便、特异且敏感性高，在杂交技术中应用较为广泛。2．膜上印迹杂交它与斑点杂交不同之处是先用凝胶电泳方法将待测核酸片段分离，然后采用印迹技术（如电转移）将分离的核酸片段转移到固相支持物上，转移后的核酸片段将保持其原来的相对位置不变，再用标记探针杂交。主要有以下几种：(1)Southernblot：DNA分子经限制性内切酶消化和琼脂糖凝胶电泳，将所得的DNA片段按分子量大小分离，放入碱性溶液使其变性，再将变性后单链DNA从凝胶中转移至硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用标记的核酸探针与膜上的核酸片段进行杂交，最后洗去未杂交的游离探针分子，通过放射自显影等检测方法显示探针的位置。(2)Northern2blot：一种经典的RNA分析法(用于组织细胞中总RNA或mRNA的定性和定量分析)，提取细胞总RNA或mRNA经变性、电泳分离，再转移至纤维膜上与探针杂交。主要观测各种基因如致病基因、耐药基因等转录产物量及其变化。(3)Westernblot：这是一种将蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳，原位转印至膜，再进行免疫测定的技术。(4)原位杂交：是应用标记的已知核酸作为探针对细胞或组织切片中的核酸进行杂交并检测的技术。该方法特异性高，并可以准确定位。二、聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）PCR是一种体外核酸扩增技术,1985年由美国Mullis博士发明，1993年获诺贝尔化学奖。由于PCR技术本身十分简单，却可以将数量很少的原始模板DNA分子进行几何级数的倍增，能最大限度地满足科学家操作DNA的要求，因此在其问世后的十多年里，PCR技术得到了迅速发展。在经典PCR基础上发展了RT-PCR、反向-PCR、锚定-PCR、原位-PCR、巢式-PCR、重组-PCR、定量-PCR等。近年来，PCR技术得到进一步发展，建立了一系列PCR扩增新技术，如等温分支扩增法(isothermalramificationamplificationmethod，RAM)、滚环扩增反应(rolling-circleamplificationreactions，RCA)、超分支滚环扩增(HRCA)、等温核酸序列基础扩增(isothermalnucleicacidsequence-basedamplification，NASBA)、分子信标实时-PCR(molecularbeaconsforreal-timePCR)和荧光探针实时定量-PCR(fluorescentreal-timequantitative-PCR,FQ-PCR)等。三、DNA指纹技术1．限制性片段长度多态性分析(restrictedfragmentlengthpolymorphism，RFLP)RFLP是利用限制性内切酶在特定的核苷酸序列上将双链DNA切割，然后进行凝胶电泳，依据片段大小不同将其分离开。由于不同生物个体核苷酸序列可能存在差异，酶切位点也会随之改变，因而产生的DNA片段长度呈现多态现象。传统的RFLP方法是指基因组DNA经限制性内切酶3酶切，电泳分离后再结合Southern印迹杂交，应用该方法可以构建DNA指纹图，这种方法特异性及敏感性均较高。目前，RFLP已广泛用于基因突变分析、基因定位和遗传病基因的早期检测等方面。RFLP具有以下优点:①在多种生物的各类DNA中普通存在；②能稳定遗传，且杂合子呈共显性遗传；③只要有探针就可检测不同物种的同源DNA分子的RFLP；④限制性内切酶的种类很多，可选择各种不同的限制性内切酶使RFLP充分表现出来，这些特点使RFLP成为一种十分重要的遗传标记。用随机克隆的DNA探针可以检测到一定水平的RFLP变异，这对于检测真菌种内及种间的变异是十分有用的。传统的DNA限制性片段长度多态性研究方法无论是核DNA、线粒体DNA,还是核糖体DNA，都有一个共同的局限性，即不仅需要大量相当纯的DNA样品，而且DNA杂交膜和探针的准备，以及杂交过程都相当耗时耗力，同时由于探针的异源性而引起的杂交低信噪比或杂交膜的背景信号太高等都会影响杂交的灵敏度。PCR技术与RFLP方法的结合使用(常被称为PCR-RFLP)，恰好克服了上述缺点，实现了不需杂交和无需放射性标记的RFLP分析。同时由于PCR技术的引入，使人们可以按自己的目的随意针对生物体DNA的不同区段进行研究，酶切图谱也易于分析，这就使对生物体多态性的分析变得简捷快速。这一方法在真菌系统学的研究中占有相当的比重。2．随机扩增多态性分析DNA(randomlyamplifiedpolymorphicDNA，RAPD)RAPD技术是1990年由美国科学家J.G.R.Williams发展起来的。他将通常PCR反应中使用的两个特定序列的引物改为单一的由10个碱基构成的随机引物，并运用大量的不同序列的随机引物进行扩增，使基因组DNA多态性充分展现出来。由于RAPD技术允许在事先未知DNA序列的情况下检测基因组中存在的多态性，大大方便和拓宽了对基因组DNA变异的研究，而使这一技术一出现就首先被用于分子系统学研究中。另外,4由于RAPD技术可以在一次反应中检测基因组的多个位点，能快速寻找两组或多组DNA样品间的多态性，并以此进行DNA分子水平的标记，从而使这一技术在病原菌群体遗传等方面几乎成为RFLP分析的替代手段，是抗病基因定位和遗传图谱构建的有力工具。RAPD技术主要包括：应用随机合成的单个寡核苷酸(8~12bp)作为引物，经PCR将模板DNA扩增，采用低退火温度使引物与模板DNA在可能有一或两个碱基错配的情况下结合形成扩增产物。扩增循环次数要求较多，一般为35～45个。特征性带型的出现取决于引物和模板的DNA序列，依照带型可以进行菌种鉴定及分型。3．单链构象多态性分析(single-strandconformationalpolymorphism，SSCP)单链构象多态性分析是指将PCR扩增得到的DNA片段变性，成为单链DNA，在一定的条件下，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将单链DNA分离。由于单链DNA的空间构象与分子内的碱基组成密切相关，一个碱基的差异即可形成不同的构象，不同构象的DNA在聚丙烯酰胺凝胶中的泳动速率不同，形成的带型则不相同，故能反映出单链DNA片段的多态性。4．扩增片段长度多态性分析(AFLP)该技术是基于PCR与RFLP的一种DNA指纹分析技术。AFLP的原理是利用两种以上的酶切割DNA形成不同酶切位点的限制酶切片段，在所得的酶切片段上加上双链人工接头,作为PCR扩增的模板。对于PCR的引物，AFLP作了修饰，将引物与酶切片段识别序列结合起来，其引物从5’-3’依次为核心序列，酶切识别序列，3’端选择碱基序列。而核心序列与人工接头互补，从而实现选择性扩增。扩增产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，显示多态性。5．变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)变性梯度凝胶电泳和温度梯度凝胶电泳是常用的电泳方法。扩增后的DNA片段在含有变性剂或具有温度梯度的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。随着DNA片段在凝胶中的移动，它们发生变性反应由双链降解为单链。DNA的变性温度(熔点)和变性时所需变性剂的量由DNA序列的核苷酸成分决定。双链5DNA中G，C碱基对含有3个氢键，断裂时需要较多的能量，因此在凝胶中移动时碱基G+C含量高的DNA比A+T含量高DNA的变性发生的晚。一旦DNA发生变性它将附着在凝胶中不再继续向前移动。电泳完成后用核酸染色剂对凝胶中的DNA染色，每种扩增DNA在凝胶中形成一条带,条带的数量表明样品中可能存在的种类数。分别将每条带切割下来并对其中的DNA进行测序，根据序列确定其种类。四、核酸序列分析核苷酸是生物体遗传信息的最基本组成单位，核苷酸序列能够为物种提供最丰富、最直接的信息。在医学真菌中，DNA序列分析对于了解真菌的基因结构、表达及分子进化关系等具有十分重要的意义。该方法可用于设计探针、特异引物等对真菌病进行诊断。核酸序列分析用于研究生物分类和进化，可以克服杂交、RFLP分析等方法所遇到的局限性。大量的性状可直接观察到，如碱基变化的转换与颠换，不活动性与有选择性，核苷酸的变化趋势，这些变化在物种系统发育分析时都可以以不同的方式表现出来，公开发表的序列都可直接用来进行所需要的比较和分析，大大拓宽了我们的研究范围。核酸序列测定是现代分子生物学中一项难度较大而重要的尖端技术。早在1965年，Holey用经典方法测出酵母丙氨酸tRNA的75个核苷酸顺序，同年Sanger提出了测定小亚基rRNA序列的指纹图谱法。1975年Sanger又提出了测定DNA序列的加减法。1977年，Maxam和Gilbert发明了化学直接法，同年Sanger创立了双脱氧核苷酸(ddNTP)链终止法。后来Messing等组建了一系列的噬菌体M13载体系统，为ddNTP链终止法提供了天然模板和万能引物，使该法成为DNA测序的最好方法。其基本原理是将待测DNA片段转变成一系列放射性核素标记的单链寡核苷酸，并使其一端为一固定的末端。另一端由于长度不同，成为一系列相差一个碱基的连续末端。在分别含有4种脱氧核酸的反应体系中，寡核苷酸分别终止于不同位置的6A、T、G或C碱基。将4种反应体系的寡核苷酸产物，在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中上样于相邻的加样孔进行电泳分离。由于全部可能产生的不同大小寡聚核苷酸都存在于4种反应产物中，从放射白显影后的4种末端寡聚核苷酸梯子形图谱中，就可以直接读出DNA的序列。五、电泳核型分析DNA分子的分离技术是分子生物学研究中的关键，无论是在对真菌的功能基因进行克隆或是运用分子系统学方法对真菌的系统发育及分类进行研究时，都离不开DNA分子的分离，可以说，DNA分子分离的好坏直接影响到最终目的的实现。目前较为常用的分离技术是琼脂糖凝胶电泳，但其分离的DNA分子的大小有一定的范围，超出这个范围，效果就不好，而脉冲场凝胶电泳技术的出现则改变了以往DNA分离范围较窄、分离效果不好的问题，它的分离能力可达到10Mb。所谓电泳核型分析就是应用脉冲电泳方法发展起来的一种实验技术，是指细胞中的染色体在一定电场作用下在固体包埋物中的排列情况，即通过电场的不断改变，使包埋在固体介质中的DNA分子泳动方向做相应的改变，小的DNA分子泳动较快，从而在凝胶上反映出染色体大小、数目和形状的差异。由于各分类水平上不同分类单位的染色体总会存在一些差异，因此其核型必然呈现出一定的多态性。电泳核型分析技术自问世以来，在真菌的染色体数目及基因组测定、基因的杂交定位及基因作图方面已得到了大量的应用，并已显示出良好的分类学价值。人们从研究中发现，真菌的核型差异是种间大于种内、属间大于种间等，与其它分类学指标吻合较好，并且它的多态性明显、分辨能力强，电泳条件稳定时结果重复性较好。目前，这项技术得到的核型图谱已广泛应用于酵母和其它真菌的分类研究中。六、重组DNA重组DNA是遗传工程的核心技术，也是揭示疾病的分子机制的重要工具。20世纪70年代Wenner等发现了细菌中的限制性核酸内切酶，称之为7生物技术分子刀。1972年Berg等应用限制性核酸内切酶首