第二十章高效液相色谱法

67第二十章高效液相色谱法一、内容提要高效液相色谱法（HPLC）是在经典液相色谱的基础上引入气相色谱的理论和技术，并加以改进而发展起来的一种高压、高效、高速、高灵敏度的色谱分析方法。其定量分析方法与气相色谱法相同。高效液相色谱仪由高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和记录数据处理系统构成。根据不同的分离对象常选择不同的固定相和流动相，常用的固定相为化学键合固定相，流动相通常用恒流或梯度洗脱方式洗脱组成。其定量方法同气相色谱法。本章重点是高效液相色谱法与经典液相色谱法和气相色谱法的比较，高效液相色谱仪的组成及仪器操作注意事项；难点是定量分析方法。二、习题（一）判断题（F）1．高效液相色谱中的流动相是分析成败的关键，它直接关系到柱效和分离度。（T）2．紫外检测器是HPLC中应用最普遍的检测器。（T）3．对于亲脂性试样的分离，合适的高效液相色谱类型为反相液－液色谱。（T）4．在高效液相色谱中，采用梯度洗脱可提高色谱的分离度。（T）5．在高效液相色谱中采用进样阀进样可以降低进样过程对整个系统的扰动。（F）6．高效液相色谱仪，通常是直接在层析柱上进样的。（T）7．化学键合相，可克服固定液的流失。（T）8．HPLC法中常用η较小的流动相。（F）9．化学键合相，对极强的酸具有很好的稳定性。（T）10．化学键合相的优点是耐溶剂冲刷。（F）11．高效液相色谱柱可以是任意形状的。（二）单选题1．在高效液相色谱中，最常用的检测器是（A）A．紫外检测器B．荧光检测器C．示差折光检测器68D．电导检测器E．蒸发光散射检测器2．在高效液相色谱中，适用于紫外检测器作流动相最合适是（A）A．在波长190nm以上无吸收峰B．在波长为254nm以上无吸收峰C．在波长为365nm以上无吸收峰D．在波长为280nm处无吸收峰E．以上均非3．在高效液相色谱中，为了获得较高柱效能，常用的色谱柱是（A）A．直型柱B．S型柱C．U型柱D．螺旋形柱E．不规则型柱4．高效液相色谱与经典液相色谱的主要区别在于（B）A．高温B．高效C．柱短D．上样量少E．流动相5．高效液相色谱与气相色谱仪比较，增加了B）A．恒温器B．高压泵C．程序升温D．检测器E．自动进样器6．在高效液相色谱中，范氏方程中的哪一项对柱效的影响可以忽略不计（D）A．涡流扩散项B．流动相的传质阻力项C．固定相的传质阻力项D．分子纵向扩散项E．以上均非7．下列固定相，能用于高效液相色谱的是（C）A．硅藻土B．氟担体C．全多孔无定形D．玻璃微球E．硅石微球8．利用高效液相色谱法对试样进行分离时，首先要选择的是（D）A．流速B．柱温C．柱压D．固定相E．检测器9．在高效液相色谱中，梯度洗脱适用于分离（D）A．几何异构体B．极性化合物C．分子量相差大的混合物D．分配比变化范围宽的复杂试样E．挥发性组分10．RP—HPLC法最常用的流动相体系是（B）A．CH3CH2OH—H2OB．CH3OH—H2OC．CH3COCH3—H2OD．CH3COOC2H5—H2OE．CHCl3—(CH3CH2)2O（三）多选题ACDE1．在高效液相色谱中，二个溶质的分离度与下列哪些因素有关（）A．增加柱长B．改用更灵敏的检测器C．更换固定相D．更换流动相E．改变流速ABC2．常用的HPLC法中色谱柱的规格是（）69A．10cmB．15cmC．25cmD．35cmE．45cmABCE3．高效液相色谱的特点是（）A．高速化B．高效化C．高压化D．高进样量E．高灵敏度ABCDE4．高效液相色谱仪的主要组成系统是（）A．高压输液系统B．进样系统C．分离系统D．检测系统E．数据处理系统BC5．高效液相色谱法对流动相的要求是（）A．应与固定相有一定的互溶度(与固定相不互溶)B．其性能应与所用检测器相匹配C．对样品有足够的溶解能力D．应尽量选用低毒高粘度的溶剂，如乙醇E．应尽量选用高沸点的溶剂以防止操作过程中溶剂挥发ABD6．HPLC法中常用的检测器有（）A．UVDB．DADC．FIDD．ELSDE．TCDABCE7．下列关于HPLC仪中高压进样阀的叙述，正确的是（）A．进样量准确B．重复性好C．可带压进样D．死体积小E．使用方便ABCDE8．化学键合相的优点是（）A．使用过程不流失B．化学性能稳定C．热稳定性好D．载样量大E．适于作梯度洗脱（四）填空题1．高效液相色谱法的分类，按固定相的聚集状态可分为及两大类，按分离机制可分为、、、四种类型。2．高效液相色谱中的反相键合相色谱是一种流动相极性固定相极性的分配色谱方法，流动相的极性可在较大范围内调整，用于分离、等各种化合物。（五）名词解释1．化学键合相2．梯度洗脱（六）简答题1．高效液相色谱有哪些特点？2．化学键合固定相有哪些优点?3．高效液相色谱对流动相的要求是什么？4．高效液相色谱仪的系统组成操作注意事项？705．全面比较高效液相色谱法和经典液相色谱法。6．全面比较高效液相色谱法和气相色谱法。（七）计算题用高效液相色谱法测定葛根素注射液中葛根素的含量。供试品溶液制备方法如下：精密量取待测葛根素注射液0.5mL至10mL容量瓶中，加NaOH至刻度，摇匀，即得。在相同色谱条件下将对照品与供试品各进样10L，色谱峰面积分别为2346785，2543272。已知葛根素对照品的浓度为0.05372mg/mL。葛根素的标示量是1.2mg/mL，其标示量的合格范围为95％～105％，试判断样品是否合格。三、答案（一）判断题1．×2．√3．√4．√5．√6．×7．√8．√9．×10．√11．×（二）单选题1．A2．A3．A4．B5．B6．D7．C8．D9．D10．B（三）多选题1．ACDE2．ABC3．ABCE4．ABCDE5．BC6．ABD7．ABCE8．ABCDE（四）填空题1．液－液，液－固，吸附，分配，离子交换，凝胶2．大于，弱极性，中等极性（五）名词解释略（六）简答题1．答：高效液相色谱法的特点是适用范围广、分离效率高、速度快、流动相可选择范围宽，灵敏度高，色谱柱可反复使用，流出组分容易收集，安全等特点。三高二广一少2．答：化学键合固定相克服了固定相易流失的缺点，并且遇强酸不分解，在各种溶剂中稳定性好，使用寿命长，可选用的流动相范围广，对热稳定，键合在担体表面上的有机基71团可根据试样的类型而改变，从而提高分离选择性。键合固定相非常稳定，在使用中不易流失。键合到载体表面的官能团是各种极性的，他适用于各种样品的分离分析，应用最广。3．答：在HPLC中，对流动相的要求是：（1）与固定相不互溶。（2）不与固定相发生化学反应。（3）对样品要有适当的溶解度。（4）必须与检测器相适应。（5）溶剂的粘度和沸点都要小。（6）避免使用毒性大的溶剂4．答：高效液相色谱仪主要由六大系统组成，即（1）高压输液系统（2）进样系统（3）分离系统（4）检测系统（5）温控系统（6）记录或数据处理系统构成。5．HPLC与LC的比较LCHPLC相同点1．理论上均可用塔板理论解释2．分离机理上均有吸附，分配，离子交换，凝胶四种分离机理不同点1．固定相颗粒全多孔无定形颗粒，30-200目，不均匀，不耐高压，在一定压力下会破碎，会造成柱效降低表面多孔形或全多孔微粒型，5-，2500-2000目，均匀，耐高压2．操作压力常压1kg/cm2或低压4-5kg/cm240-200kg/cm2或500-4000psi3．柱效（n/米）2-50103-1044．样品用量1-10g10-5-10-4g如1000ng，5-5．分析时间1-24小时甚至几个月10-60min6．装置间断，非仪器化连续，仪器自动化，RSD≤3．0%7．柱长0．5-2米，粗，用一次10-25cm，短，可重复使用（毛细管除外）6．HPLC与GC的比较GCHPLC相1．柱效均具有较高的柱效72同点2．灵敏度均具有较高的灵敏度3．分析速度均具有较快的分析速度不同点1．流动相气体，可压缩，扩散系数大，粘度小液体，不可压缩，扩散系数小，粘度大2．流动相产生高压钢瓶高压输液泵3．与组分关系惰性气体液体，与组分有作用力4．分析对象20-30%气体和低沸点的化合物，易挥发，热稳定70-80%有机，无机物，只要能配成溶液5．压力测试压力表压力传感器6．进样位置柱上直接进样（柱口，分流/不分流），t0小进样阀，t0大7．柱形U形，随意，螺旋形直形8．柱长＞1m，2-100m10-30cm