第二章-种子的扩大培养

•种子制备的过程•影响种子质量的因素•种子制备的放大原理与技术第五章种子的扩大培养将冷冻干燥管、砂土管中处于休眠状态的工业菌种接入试管斜面活化后，再经摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种的过程。这些纯培养物都称为种子。什么叫种子？种子扩大培养的任务工业生产规模的增大需要种子就增多种子要进行扩大培养种子扩大培养的任务：提供发酵产量高、性能稳定、接种数量足够的、纯的培养物。种子扩大培养流程图孢子制备种子制备一、种子制备的过程孢子制备放线菌孢子的制备放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。碳源和氮源不太丰富（碳源约1%，氮源不超过0.5%）。碳源丰富易造成生理酸性的营养环境，不利于放线菌孢子形成；氮源丰富有利于菌丝繁殖不利于孢子形成。斜面培养温度大多28℃，培养时间5~14天放线菌发酵生产的工艺过程菌种进入种子罐有两种方法一种为孢子进罐法一种方法为摇瓶菌丝进罐法霉菌孢子的制备霉菌的孢子培养，一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。这是由于这些农产品中的营养成分较适合霉菌的孢子繁殖，而且这类培养基的表面积较大，可获得大量的孢子。霉菌的培养一般为25～28℃，培养时间为4～14天。细菌孢子的制备细菌斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方。牛肉膏、蛋白胨常用作有机氮源细菌培养温度的大多数37℃，少数为28℃细菌菌体培养时间一般1～2天，产芽孢的细菌则需培养5～10天种子制备摇瓶种子制备◆某些孢子发芽和菌丝繁殖速度缓慢的菌种，需将孢子经摇瓶培养成菌丝后再进入种子罐，这就是摇瓶种子。◆一般采用母瓶、子瓶两级培养，有时母瓶也可直接进罐。◆要求培养基营养丰富完全，氮源丰富有利于菌丝生长；各种营养成分不宜过浓，子瓶比母瓶略高，更接近种子罐的培养基配方举例：◆产链霉素的灰色链霉菌（S.griseus）、产卡那霉素的卡那链霉菌（S.Kanamuceticus）可以用摇瓶液体培养法。将孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇瓶机上恒温振荡培养，获得菌丝体，作为种子。其过程如下：试管→三角瓶→摇床→种子罐种子罐种子制备◆种子罐种子制备的工艺过程，因菌种不同而异，一般可分为一级种子、二级种子和三级种子的制备。◆孢子(或摇瓶菌丝)被接入到体积较小的种子罐中，经培养后形成大量的菌丝，这样的种子称为一级种子；把一级种子转入发酵罐内发酵，称为二级发酵，如谷氨酸发酵；三级发酵：青霉素和链霉素；四级发酵。。。种子罐培养：获得足够的菌种数量；种子罐的培养基接近发酵罐培养的醪液成分和培养条件，使菌体适应发酵环境。种子罐级数的确定种子扩大的级数：制备种子需逐级扩大培养的次数种子罐级数越少，越有利于简化工艺和控制，并减少由于多次转种而带来的染菌机会以及减少因种子罐生长异常而造成的发酵波动但考虑能否在一定时间内获得优质、足量的种子以满足发酵的需求确定方法菌种的性质(如菌种传代后的稳定性)瓶中的孢子数，孢子发芽及菌丝繁殖速度发酵罐中种子培养液的最低接种量种子罐与发酵罐的容积比生产规模随工艺条件的改变作适当的调整举例：•细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵。茄子瓶→种子罐→发酵罐•霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵孢子悬浮液→一级种子罐（27℃,40小时孢子发芽，产生菌丝）→二级种子罐（27℃，10~24小时，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体）→发酵罐•放线菌：生长更慢，采用四级发酵•酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子二、影响种子培养的条件1、营养条件（1）原材料质量●如微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也会影响孢子的质量。例如：因原料产地、品种、加工方法及用量的不同对种子质量的影响也不同（2）水质的影响●地区不同、季节变化和水源污染，均可造成水质波动，影响种子质量。（3）代谢类型●菌种在固体培养基上可呈现多种不同代谢类型的菌落，氮源品种越多，出现的菌落类型也越多，不利于生产的稳定。2、培养条件（1）温度●如：土霉素生产菌种在高于37˚C培养时，孢子接入发酵罐后出现糖代谢变慢，氨基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。（2）湿度●如：土霉素生产菌种龟裂链霉菌，孢子制备时在北方气候干燥地区孢子斜面长得较快，在含有少量水分的试管斜面培养基下部孢子长得较好，而斜面上部由于水分迅速蒸发呈干疤状，孢子稀少。主要由于试管下部冷凝水多而不利于孢子的形成。一般相对湿度在40%~45%时孢子数量最多，且孢子颜色均匀，质量较好。（3）培养时间：●一般来说，衰老的孢子不如年轻的孢子，因为衰老的孢子已在逐步进入发芽阶段，核物质趋于分化状态。过于衰老的孢子会导致生产能力的下降。（5）pH●pH影响菌体的生长和代谢（6）通气搅拌●影响培养基中的溶氧，通气过大或搅拌速度过快容易导致某些酶失活或菌体细胞破裂。（4）冷藏时间●如：土霉素生产菌种孢子斜面培养4天左右即于4˚C冰箱保存，发现冷藏7~8天菌体细胞开始自溶。而培养5天以后冷藏，20天未发现自溶。3、接种量和种龄的影响移入种子的体积接种量＝—————————接种后培养液的体积接种量大小最终以实践定。接种量过多：菌丝生长过快、溶氧不足，衰老细胞增加等，发酵后劲不足种量过少：延长发酵周期，形成异常形态，而且易造成染菌。以生产菌种在发酵罐中的繁殖速度为依据接种量的大小直接影响发酵周期。种龄是指种子罐中培养的菌体从接种开始到移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。∵时间太长，菌种趋于老化，生产能力下降，菌体自溶；种龄太短，造成发酵前期生长缓慢。∵不同菌种或同一菌种工艺条件不同，种龄是不一样的，一般需经过多种实验来确定。∴通常以对数生长期较为合适。4、种子罐的级数：5、染菌的控制：三、种子制备的放大原理与技术•细菌发酵时的种子扩大培养举例•酵母发酵时的种子扩大培养举例•丝状真菌发酵时的种子扩大培养举例•放线菌发酵时的种子扩大培养举例梭状芽孢杆菌发酵丁醇－丙酮时种子扩大培养的程序举例：举例：谷氨酸发酵的菌种扩大培养的程序斜面菌种→一级种子培养→二级种子培养→发酵罐1、斜面菌种的培养菌种的斜面培养必须有利于菌种生长而不产酸，并要求斜面菌种绝对纯，不得混有任何杂菌和噬菌体，培养条件应有利于菌种繁殖，培养基以多含有机氮而不含或少含糖为原则。(1)斜面培养基组成葡萄糖0.1%，蛋白陈1.0%，牛肉膏1.0%，氯化钠0.5%，琼脂2.0~2.5%，pH7.0~7.2（传代和保藏斜面不加葡萄糖）。(2)培养条件33~34℃，培养18~24h。2、一级种子培养•一级种子培养的目的在于大量繁殖活力强的菌体，培养基组成应以少含糖分，多含有机氮为主，培养条件从有利于长菌考虑。•(1)培养基组成•葡萄糖2.5%，尿素0.5%，硫酸镁0.04%，磷酸氢二钾0.1%，玉米浆2.5~3.5%(按质增减)，硫酸亚铁、硫酸锰各2ppm，pH7.0。•(2)培养条件•用1000mL三角瓶装入培养基200mI，灭菌后置于冲程7.6cm、频率96次/min的往复式摇床上振荡培养12h，培养温度33~34℃。•(3)一级种子质量要求•种龄：12h，pH值：6.4±0.1光密度：净增OD值0.5以上•残糖：0.5％以下无菌检查：(-)•噬菌体检查：(-)•镜检：菌体生长均匀、粗壮，排列整齐•革兰氏阳性反应。3、二级种子培养•为了获得发酵所需要的足够数量的菌体，在一级种子培养的基础上进而扩大到种子罐的二级种子培养。种子罐容积大小取决于发酵罐大小和种量比例。•(1)培养基组成培养基组成（%）T6-13B9T738AS1.299水解糖玉米浆磷酸氢二钾硫酸镁尿素Fe++（ppm）Mn++（ppm）pH2.52.5-3.50.150.040.4226.8-7.02.52.5-3.50.150.040.4226.8-7.02.52.5-3.50.20.050.5227.02.52.50.10.040.5226.5-6.8(2)培养条件•接种量：0.8~1.0％•培养温度：32~34℃•培养时间：7~8h•通风量：•50L种子罐1:0.5•搅拌转速340r／min；•250L种子罐1:0.3•搅拌转速300r／min•500L种子罐1:0.25•搅拌转速230r／min(3)二级种子的质量要求•种龄：7~8h•pH：7.2左右•OD值净增0.5左右•无菌检查(-)•噬菌体检查(-)酵母发酵时的种子扩大培养•酿酒酵母的扩大培养Hansen等最初采用纯种进行酵母发酵并设计出酵母繁殖流程，他将每一步的接种量规定为10％，并控制繁殖条件与酿造时一致现代的流程中，接种量为1%或更低，控制的条件也与酿造时不同。一般可采用三级扩大培养，扩大倍数：第1级到第2级为8-10倍，第2级到第3级为4-6倍。举例：1、实验室扩大培养2、车间扩大培养面包酵母时的种子扩大培养的程序丝状真菌发酵的种子扩大培养◆丝状真菌既可以利用孢子，也可以利用菌丝体作为接种物接种到发酵罐进行发酵举例：在固化的培养基上产生孢子“滚瓶”技术应用于产黄青霉的孢子生产在固体培养基上产生孢子在谷类的颗粒表面形成大量的孢子在液体深层培养基中产生孢子（1）利用孢子作为接种物灰黄霉素产生菌展青霉一试验表明在良好的通气条件下，培养基中含氮是在0.05～0.1％（w/v）之间时，可以产生大量的孢子(2)利用菌丝体作为接种物•不能产生无性孢子的用繁殖体菌丝作为接种物，如生产赤霉素的菌种—藤仓赤霉•问题：难以获得均一的接种物•接种前将菌丝打成碎片，形成大量的菌丝段，它具有大量的生长点放线菌发酵时的种子扩大培养•斜面培养，制备孢子悬浮液作初级种子•可用培养摇瓶菌丝体作为初级种子举例：