第五节土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(一)

土壤中分解尿素的细菌的分离与计数（一）主讲：黄冈中学优秀生物教师王小敏课题背景：1、尿素的利用尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、细菌利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶CO(NH2)2＋H2OCO2＋2NH33、常见的分解尿素的微生物芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。4、课题目的①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌。②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。一、研究思路（一）筛选菌株1、实例：DNA多聚酶链式反应（PCR)是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（93℃）的DNA聚合酶。该酶存在于水生嗜热菌（Thermusaquaticus)中。问题：为什么Taq细菌能从热泉中被筛选出来呢？原因：因为热泉温度70～80℃，淘汰了绝大多数微生物只有Taq细菌被筛选出来。启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。2、实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等；方法：（1）抑制大多数微生物不能生长；（2）造成有利于该菌生长的环境。结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：KH2PO41.4gNaH2PO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素1.0g琼脂15.0g①从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素4、培养基选择分解尿素的微生物的原理培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。（二）统计菌落数目计数法：直接计数法、平板计数法、比浊法、膜过滤法1、直接计数法：最常用的显微镜直接计数法。显微镜直接计数：先将待测样品制成悬液，利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。根据在显微镜下观察到的微生物数目来计算出单位体积内的微生物总数。缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；2、间接计数法（活菌计数法）（1）原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。（2）常用方法：稀释涂布平板法。每克样品中的菌落数＝（C÷V)×MC：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积（ml)，M：代表稀释倍数。例1、某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml）（）A．2.34×108B．2.34×109C．234D．23.4例2、两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数106的培养基中，得到以下两种统计结果。1、第一位同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。2、第二位同学在该浓度下涂布了三个平板，统计的菌落数分别为21、212和256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。你认为哪位同学的结果接近真实值？你认为这两位同学的实验需要改进吗？如果需要，如何改进？分析：第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了3个平板，但是，其中第1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。启示：在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。例3、样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目。实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板。测定土壤中细菌的数量，一般选用104、105和106倍的稀释液进行平板培养；测定放线菌的数量，一般选用103、104和105倍稀释；测定真菌的数量，一般选用102、103和104倍稀释，根据这些数据，请你思考旁栏中的问题。当你第一次做这个实验的时候，可以将稀释的范围放宽一点。例如，可以将103～107倍的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300间的平板进行计数。为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？分析：这是因为土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。3、统计菌落数目的注意事项①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。④涂布平板法所选择的稀释度很重要，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离。一般以三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在50个左右为最好。（三）设置对照：设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。原因：⑴土样不同，⑵培养基污染或操作失误（或者是混入了其他的含氮物质)方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。典型例题例1、下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是（）A．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、尿素、琼脂、水B．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、琼脂、水C．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、尿素、琼脂、水D．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水答案：A例2、统计菌落数目的方法有（）①涂布平板法②重量法③直接计数法④比浊法⑤生理指标法⑥膜过滤法A．①②③⑥B．③④⑤⑥C．②③④⑥D．①③④⑥答案：D例3、下列关于测定土壤中微生物数量的叙述，正确的是（）A．一般选用103～107倍的稀液分别涂布B．测定放线菌的数量，一般选用103、104和105倍稀释C．测定真菌的数量，一般选用103、104和105倍稀释D．当第一次测量某种细菌的数量，可以将101～107倍的稀释液分别涂布到平板上培养答案：B-返回-同步测试一、选择题1、使用选择培养基的目的是（）A．培养细菌B．培养真菌C．使需要的微生物大量繁殖D．表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别2、下列说法不正确的是（）A．科学家从70－80度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶B．统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值C．设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度D．同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。3、为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（）A．较多的氮源物质B．较多的碳源物质C．青霉素类药物D．高浓度食盐4、在做分离分解尿素的细菌实验时，A同学从对应106培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只选择出大约50个菌落。A同学的结果产生原因（）①由于土样不同②由于培养基污染③由于操作失误④没有设置对照A．①②③B．②③④C．①③④D．①②④5、关于土壤取样的叙述错误的是（）A．土壤取样，应选取肥沃、湿润的土壤B．先铲去表层土3cm左右，再取样C．取样用的小铁铲和信封在使用前不用灭菌D．应在火焰旁称取土壤6、下列关于从土壤中分离细菌的操作步骤中，正确的是（）①土壤取样②称取10g土壤取出加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中③吸取0.1mL进行平板涂布④依次稀释至101、102、103、104、105、106、107稀释度A．①→②→③→④B．①→③→②→④C．①→②→④→③D．①→④→②→③7、下列关于测定土壤中细菌数量的叙述，正确的是（）A．一般选用103～107倍的稀液分别涂布B．测定放线菌的数量，一般选用103、104和105倍稀释C．测定真菌的数量，一般选用103、104和105倍稀释D．当第一次测量某种细菌的数量，可以将101～107倍的稀释液分别涂布到平板上培养8、下列关于微生物的培养叙述错误的是（）A．细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2dB．放线菌一般在25～28℃的温度下培养5～7dC．霉菌一般在25～28℃的温度下培养3～4dD．不同种类的微生物，一般需要相同的培养温度和培养时间9、下列操作需要在火焰旁进行的一组是（）①土壤取样②称取土壤③稀释土壤溶液④涂布平板⑤微生物的培养A．①②③④⑤B．②③④⑤④⑤C．③④⑤D．②③④10、下列可以鉴定出分解尿素的细菌的方法是（）A．以尿素为唯一氮源的培养基中加人酚红指示剂B．以尿素为唯一氮源的培养基中加入二苯胺试剂C．以尿素为唯一氮源的培养基中加入苏丹Ⅲ试剂D．以尿素为唯一氮源的培养基中加入双缩脲试剂11、土壤取样时最好选择哪种环境中的土壤做分离细菌的实验（）A．街道旁B．花盆中C．农田中D．菜园里CBCACCBDDAD二、非选择题12、统计菌落数目一般用稀释涂布平板法，当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个__________，来源于样品稀释液中的一个__________。计数时一般选择菌落数在__________的平板计数。13、在做本课题实验时，一位同学在稀释倍数为106的培养基中涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21、212和256，该同学以这3个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。你认为这一结果是否接近真实值?如果需要改进，如何改进?14、在进行操作本课题实验时应特别注意：__________、__________、__________。15、在105稀释度下求出3个平板上菌落数的平均值是63，那么每克样品中的菌落数是多少?显示答案12、菌落活菌30～30013、不接近真实值，需要重新实验。14、无菌操作作好标记规划时间15、6.3×107-END-课外拓展酵母菌的基因组组成在酿酒酵母测序计划开始之前，人们通过传统的遗传学方法已确定了酵母中编码RNA或蛋白质的大约2600个基因。通过对酿酒酵母的完整基因组测序，发现在12068kb的全基因组序列中有5885个编码专一性蛋白质的开放阅读框。这意味着在酵母基因组中平均每隔2kb就存在一个编码蛋白质的基因，即整个基因组有72%的核苷酸顺序由开放阅读框组成。这说明酵母基因比其它高等真核生物基因排列紧密。如在线虫基因组中，平均每隔6kb存在一个编码蛋白质的基因；在人类基因组中，平均每隔30kb或更多的碱基才能发现一个编码蛋白质的基因。酵母基因组的紧密性是因为基因间隔区较短与基因中内含子稀少。酵母基因组的开放阅读框平均长度为1450bp即483个密码