第八章酶分子定向进化(提纲)2013

第八章酶分子定向进化一、酶分子定向进化的目的为什么要研究酶的定向进化?天然酶的局限性在机体外复杂体系中，酶催化的精确性较低存在产物抑制稳定性差，活性低，催化效率低有些缺乏有商业价值的催化功能及其它性质现代生物工程的要求能具备长期稳定性和活性能适用于水及非水相环境能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底物能够在特殊环境中合成和拆分制作新药物或药物的原材料利用基因工程、蛋白质工程的原理和计算机技术对天然酶进行改造或构建新的非天然酶具有重要研究意义和应用前景。二、酶分子的改造酶分子的理性设计：在研究天然酶及其突变株时，通常先获得酶分子特征、空间结构以及结构与功能的关系等方面信息，这些用各种生物化学、晶体学光谱学等方法来解决，然后根据这些信息进行酶分子的改造，这就是酶分子的理性设计。酶分子的非理性设计：不需准确知道酶蛋白结构与功能等信息，直接通过随机突变、基因重组、定向选择或筛选等方法进行酶分子的改造，称为酶分子的非理性设计。问题：定向进化是不是定点突变？澄清一个事实：定向进化不是定点突变定向进化：突变筛选突变位点是随机的，不确定的；突变位点的数目也是不确定的；突变的效应更是不可预知的；理论上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的、化学的、生物的）都可以应用于定向进化中突变体的产生。定点突变：突变位点是确定的，突变的个数也是预知的；突变的效应可能是已知的，也可能是未知的；定点突变的方法一般是以PCR技术为基础的。什么是酶的定向进化?从一个或多个已经存在的亲本酶（天然的或人为获得的）出发，经过基因的1突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过筛选最终获得预先期望的具有某些特性的进化酶。酶分子定向进化研究的历史萌芽阶段：20世纪60年代SolSpiegelman利用RNA噬菌体Q巧妙地在体外模拟了自然进化的过程奠基阶段：20世纪80年代建立了一种在基因水平上、用非合理设计方法改造酶分子的新思想发展阶段：20世纪末期易错PCR和DNA改组方法被成功开发，标志着酶分子定向进化技术的成熟如何使酶分子定向进化?定向进化=随机突变+正向重组+选择或筛选三、酶分子定向进化的基本策略和方法定向进化的基本策略一般而言，定向的分子进化有三种方法：（1）连续随机突变继之筛选出最佳改进的单一突变体，使每个循环含1-2有益突变的积累。（2）随机突变继之筛选两个或更多的改进的突变体重组，使有益突变组合并消除有害突变。（3）同源基因顺序重组(族改组)产生功能嵌合蛋白质，并且允许一步完成许多有益突变的组合，包括非累加突变。定向进化的两个重要环节多样性基因文库的构建文库中所期望的进化酶的挑选定向进化的基本过程酶定向进化通常分3步进行：通过随机突变和(或)基因体外重组创造基因多样性导入适当载体后构建突变文库通过灵敏的筛选方法，选择阳性突变子。这个过程可重复循环，直至得到预期性状的酶定向进化的基本方法无性进化易错PCR、定点饱和突变、化学诱变剂介导的突变、致突变株产生随机突变和随机寡核苷酸突变等有性进化DNA改组（DNAshuffling）、外显子改组（exonshuffling）、随机引物体外重组法（RPR）、交错延伸法（StEP）等。易错PCR(error-pronePCR)技术为代表的无性进化2一种相对简单、快速廉价的随机突变方法。通过改变PCR反应条件，使扩增的基因出现少量碱基错配，从而导致目的基因的随机突变。关键是控制DNA的突变频率。易错PCR技术的特点优点操作简便，随机突变丰富缺点正突变的概率低，中性突变较多，突变基因文库较大，文库筛选工作量大，一般适用于较小基因（800bp)连续易错PCR(Sequentialerror-pronePCR将第一轮PCR扩增得到的有益突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复进行随机突变，使每一轮获得的少量突变累积而产生重要的有益突变。e.g.1993年DNA改组技术(DNAshuffling)为代表的有性进化又称DNA重排技术或有性PCR，指DNA分子的体外重组，是基因在分子水平上进行有性重组。通过改变单个基因（或基因家族）原有的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能。分子育种DNA改组技术基本过程：从两种以上同源正突变基因出发，用酶切割成随机片段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起基因突变。3DNA改组原理DNA改组与常规定向进化的比较DNA改组技术的特点优点正突变的概率较高、进化速度较快缺点需要利用DNaseI随机切割，获得DNA随机片段，在进行无引物PCR获得全长突变基因之前，必须将DNaseI去除干净，以免突变基因再被切割。改进1：交错延伸技术(Staggeredextensionprocess,StEP)4····1997年,Arnold等人提出了交错延伸PCR技术。原理：用PCR同时扩增多个拟重组的模板序列时，在热循环中大大缩短退火与聚合酶催化延伸的时间。优点：多样性，操作简单，无需片段纯化，重组发生在单一试管中缺点：依赖于序列同源性，目的基因特异性的PCR条件优化耗时改进2:体外随机引动重组(Random-priminginvitrorecombination,RPR)原理：用随机序列的引物来产生互补于模板序列不同部分的大量的DNA小片段。主要优点：利用单链DNA为模板，所需亲本DNA的量比DNA改组少10~20倍。可省去DNaseI切割这一步骤，操作更简便。合成的随机引物长度一致并缺乏序列的偏向性（不要求等位），保证了点突变和交换在全长的后代基因中的随机性。随机引导的DNA合成不受DNA模板长度的影响,有利于小肽的改造。基因家族改组（族改组）技术该改组技术和DNA改组技术大致相同。Crameri等人于1998年首次提出。区别在于前者从基因家族的若干同源基因出发，而后者从基于易错PCR获得的两个以上的正突变基因出发。同源性高，获得杂合体几率低。其它技术在以上基本方法的基础上又不断的发展出一些新的方法，例如：外显子改组法、酶法体外随机-定位诱变法、过渡模板随机嵌合基因法、非同源依赖型蛋白质重组法等。四、酶突变基因的筛选技术定向进化的筛选技术5·在定向进化中尽管突变体具有随机性，但通过选择特定方向的突变，限定了进化趋势，加之控制实验条件，限制突变种类，降低突变率，缩小突变库的容量，不仅减少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的进化速度。手段:高通量筛选技术建立（对比以前的挑单菌落摇瓶复筛，筛选数目多，试剂少，信号灵敏，自动化程度较高）1、平板筛选法1）根据细胞生长情况筛选突变基因······热抗生素pH高渗透压低温有毒物及抑制剂2）依据颜色变化筛选颜色变化是最简便的追踪酶反应的方法，如用对硝基苯基衍生物检测水解酶的活性。根据水解释放出的黄色对硝基苯酚或对硝基苯胺来进行检测。大多数酶并不能直接引起颜色变化，为了检测一个没有生色基团的底物的反应，需要将反应产物转变为一个有色化合物。3）用透明圈筛选突变酶··淀粉酶，蛋白酶等分泌后会在平板上产生水解透明圈一般酶活越大，水解圈越大。2、荧光筛选法·荧光检测法具有灵敏性高、方法简便、直观、明确、容易判断等优点，但需要利用具有荧光激发特性物质的基因作为报告基因。该方法可以使用很稀的底物浓度和极少量的催化剂进行检测，在高通量筛选中被广泛应用。3、噬菌体表面展示法噬菌体表面展示法是将外源蛋白或多肽以与噬菌体外膜结构蛋白（衣壳蛋白）融合的形式表达并展示在噬菌体表面的一种分子展示技术。丝状噬菌体的衣壳蛋白有多种，主要是g3p、g6p、g7p、g8p、g9p等，若外源基因带有终止信号，通常采用g6p蛋白。外源蛋白与噬菌体衣壳蛋白的结合方法6通过基因重组技术，构建外源基因与噬菌体衣壳蛋白基因的融合基因，融合基因表达生成外源蛋白与噬菌体衣壳蛋白的融合蛋白外源基因与噬菌体衣壳蛋白基因分别与可以相互作用的介导蛋白基因形成融合基因，表达出来的两种融合蛋白，可以通过介导蛋白的相互作用结合在一起4、细胞表面展示法通过可以锚定在细胞表面的特定蛋白质与某些外源蛋白质或多肽形成稳定的复合物，使这些外源蛋白质或多肽富集在细胞表面的一种分子展示技术。（1）酵母细胞表面展示法酵母细胞表面的特定蛋白质（凝集素蛋白、絮凝素蛋白等）与某些外源蛋白质或多肽形成稳定的复合物，使这些外源蛋白质或多肽富集在酵母表面。S.cerevisiae易培养、安全、适用范围广适用于真核生物蛋白库的构建，有较高的库容量（105-106)展示可溶性蛋白（104-105proteincopies/cell），在细胞表面直接检测蛋白，无须破碎细胞检测在单细胞中实现基因与表型的耦联，易于实现蛋白定向进化的高通量快速筛选（106cells/s）具有固定化酶的特征，易实现酶的定向进化与发酵耦联（2）细菌细胞表面展示法···革兰氏阴性菌的外膜蛋白仅有一些表面环可作为插入外源蛋白的“允许位点”，并且通常只允许插入很短的外源蛋白。单层膜转移阳性菌结构坚固革兰氏阳性菌的一个潜在问题是其转化率较低。75、核糖体表面展示法体外核糖体展示肽库构建与筛选原理示意图特点通量大、筛选效率高目的蛋白基因在体外进行转录和翻译，有效基因通过核糖体表面展示进行富集不足需要对目的基因进行加工与修饰，使其体外翻译时能够形成目的蛋白质-核糖体-mRNA三聚体五、酶分子定向进化的应用1、提高酶分子的催化活力这是对酶分子进行改造的最基本愿望之一，大多数酶的定向进化都涉及对目标酶催化活力的提高，还同时提高了酶的其它性能。2、提高酶分子的稳定性在酶分子进化研究中，大量的研究目标是提高酶分子的热稳定性。e.g.Joyet等人通过定向进化，获得热稳定性大大提高的α-淀粉酶，该酶在90℃的半衰期延长9-10倍。3、提高酶分子对环境的适应能力天然酶在生物体内存在的环境与酶的实际应用环境往往不同，采用定向进化的方法提高酶分子对环境的适应能力十分必要。e.g.枯草杆菌蛋白酶E的定向进化，获得的突变体在二甲基甲酰胺（DMF）中催化肽合成反应时，活力远高于野生型酶。4、提高底物专一性或拓宽特异性底物范围通过定向进化可改变酶的Km值，即改变酶的底物专一性；反之，有些酶通过定向进化反而拓宽了酶的特异性底物范围。e.g1.Aharoni等人采用基因家族重排技术对大肠杆菌磷酸酶进行分子定向进化研究，使该酶对有机磷酸酯的特异性提高2000倍。e.g2.Fong等利用易错PCR、DNA改组技术，获得一个能催化非磷酸化的D-甘油醛和L-甘油醛的进化酶。5、提高酶分子的对映体选择性运用定向进化的方法，可以提高酶的对映体选择性。e.g.Arnold等运用易错PCR和饱和诱变的方法，使一株倾向于D型底物的8乙内酰脲酶发生转变，使之变得倾向于L型底物6、创造新的酶活性利用定向进化的方法改造酶，使其具有新的特异性和活性。定向进化可以补充不够理想的合理设计，创造出具有全新功能的新酶。e.g.Fersht等将吲哚-3-甘油磷酸合成酶中α/β桶蛋白支架进行氨基酸替换，再通过两轮DNA改组和StEP重组，得到一个突变体，它具有磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶的活性，比野生型的高6倍，但不具有合成酶活性。本章小结掌握有关酶分子定向进化的基本概念掌握酶分子定向进化的基本策略和基本方法掌握酶突变基因的基本筛选技术了解酶分子定向进化的应用思考题简述酶分子定向进化的基本策略与方法。酶突变基因的高通量筛选技术主要有哪些？各有何特点？定向进化对于酶性质改造方面有哪些应用？9