生化技术重点1

1、紫外-可见光分光光度法在有机化合物中的应用，多数都是建立在π→π*和n→π*跃迁的基础上。π→π*跃迁与n→π*跃迁的重要区别①摩尔吸光系数不同：π→π*摩尔吸光系数在104左右，n→n*跃迁的摩尔吸光系数小，在10-100范围②溶剂的极性对这两种跃迁的吸收峰波长影响不同（溶剂效应）：溶剂极性增加时，π→π*红移，n→π*蓝移。2、原子吸收分光光度法与紫外可见分光光度法的比较本质：原子吸收/分子吸收；谱带：线状光谱/带状光谱；光源：锐线光源/连续光源；被测物状态：原子状态原子蒸气/分子状态、溶液；仪器结构：分光系统在原子化器之后/分光系统在比色杯之前；温度：高温/常温3、离子选择性电极的一般作用原理：当电极置于溶液中时，电极膜与溶液界面的离子交换和扩散作用，改变两相界面原有电荷分布形成双电层产生膜电位；因参比电极电位固定，所以ISE只随溶液中待测离子活度或浓度变化而变化。4、简述聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点1具有分子筛作用，分离效果好2设备简单，样品用量少，不易扩散，分辨率高3不带电荷，几乎没有电渗作用4可通过控制凝胶浓度来调整凝胶的孔径，以适合不同分子量样品的分离5化学稳定性好，由于分子结构中富含酰胺基，聚丙烯酰胺凝胶是一种稳定的亲水胶体6机械性强度好，有弹性，无色透明，易观察，可用检测仪直接测定。5、高效液相层析法HPLC与气相色谱法GC的比较a共同点：①色谱的基本理论一致②定性定量原理完全一样③自动化程度高b流动相差别：GC用气体做流动相，气体与样品分子之间作用力可忽略，载气种类少性质相近，改变载气对柱效和分离效率影响小；HPLC以液体做流动相，液体分子与样品分子之间作用力不可忽略，液体种类多性质差别大，是控制柱效和分离效率的重要因素之一，使HPLC除了固定相的选择外增加了一个可供选择的重要操作参数c固定相差别d使用范围更广。GC一般分析沸点500c以下，相对分子量少于450的物质，而对热稳定性差易于分解变性及具有生理活性的物质都不能用升温气化的方法分析。HPLC在室温或接近室温的条件下工作，可分析沸点在500c以上相对分子质量在450以上的有机物质，范围远远超过GC。E原理和结构差别。7、如何选择内标物？内标法优缺点。对内标物的要求是纯度高，结构与待测组分相似。内标峰要与组分峰靠近但能很好分离，内标物和被测组分的浓度相接近。内标法的优点是定量准确测定条件不受操作条件、进样量及不同操作者进学技术的影响。缺点是选择合适的内标物较困难，每次需准确称量内标物和样品增加了色谱分离条件的难度。8、何为层析技术？如何分类？概念：基于物质的物理化学和生物学特征的不同，在某种介质中的移动速度不同进而对物质进行分离和分析的技术，即层析技术分类：①按流动相和固定相的状态分类：液相层析法、气相层析法②按层析法分离原理分类：分配层析法、吸附层析法、亲和层析法、凝胶层析法、离子交换层析法③按操作方式不同分类：纸层析法、薄膜层析法、薄层层析法、柱层析法9、米氏常数在酶学分析中的意义？km是酶极为重要的动力学参数。意义：1鉴别酶的最适底物2由于存在km值不同而功能相同的酶从而发现同工酶3判断细胞内酶的活性是否受底物抑制4测定不同抑制剂对某个酶km及Vmax的影响可以区别该抑制剂是竞争性抑制剂还是非竞争性抑制剂5已知某个酶的km，可以计算出某个底物浓度时。其反应速度相当于最大速度的分数6利用工具酶来测定体液中某一成分的浓度或某一种酶活力时，可以根据衍生出来的公式计算工具酶所需要的活力单位7设计适宜的底物浓度。10、何谓酶活性测定的固定时间法和连续监测法？各有何优缺点？固定时间法：测定酶反应开始后某一时间内产物或底物浓度的总变化量来求取酶反应初速度的方法。优点：简单因最后测定产物时酶反应已经终止，故分光光度计可无需保温装置，显色剂的选择也可以不考虑对酶活力的影响。缺点：因为不用预实验确定，无法了解酶作用的这段时间内是否都是零级反应，难保证测定结果的真实性。连续监测法：酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间的变化来求出酶反应速度的方法。优点：可将多点的测定结果连接成线，很容易找到成直线的区段，可以观察到是否偏离零级反应可选择线性反应期来计算酶活力，不需要终止反应。缺点：对仪器要求高，PH和底物对反应有影响，仪器要恒温。11、酶偶联测定中常用指示酶？常检测的指示反应？利用氧化还原酶反应原理连接到NAD(P)+-NAD(P)H的反应后直接通过分光光度法或其他方法测定NAD(P)H的变化量。1、NAD(P)+或NAD(P)H偶联的脱氢酶及其指示反应，这类方法基于NADH或NADPH在340nm处有特征性的吸收峰而NAD+或NADP+在300和400nm之间没有吸收峰。2、偶联H2O2的工具酶及其指示反应。反应生成红色醌亚胺化合物，在500nm处有最大吸收峰2H2O2+酚+4-AAP→红色醌亚胺化合物+4H2O12、简述标本溶血对临床生化测定的影响及防止方法？影响：使检测项目的结果分析变得更加复杂，这是在超微量高精度和多指标的检测分析中显然不可忽视。方法：注射器和容器要干净，抽血时使用的针头不要过小，抽血用力不要过大，不要较长时间使用止血带，不要产生过多泡沫，抽血后应取下针头再将血液注入容器，混匀抗凝剂时用力不要过大等13、溶血对生化试验的干扰机理：一是血细胞中高浓度组分逸出，使测定结果增高，二是血细胞成分进入血清后因化学反应而引起其他物质的浓度改变，三是血红蛋白本身颜色对检测的光学干扰。14、系统误差SE在相同的条件下，多次测量同一量值时，误差的大小和正负保持不变，或在测量条件改变时按一定规律变化的误差。①特点：为可测误差；可纠正；具有单向性，没随机性，不服从正态分布规律，通过增加测量次数不能消除。②原因-方法/理论误差、仪器误差、试剂误差、操作误差。③表现形式：a比例系统误差（线性系统误差）-与被测物浓度有相同百分比的误差，随被测物浓度的变化成比例变化；b恒定系统误差-是由某种干扰物引起的、使测定结果恒定的偏向一方、增高或减少的量相同的误差。④纠正方法：减小方法的误差；做空白试验；使用标准化的试剂和标准品；严格控制实验条件；注意仪器校正。15、随机误差RE在同一测试条件下，多次重复测量同一量值时，误差的大小和正负均以不可预知的方法变化着的误差。①特点：数据呈正态分布；不可预测不易控制；通过增加测量次数可减小；小误差出现机会多，大误差出现机会较少；分析步骤越多，此类误差出现机会越大。②原因：偶然因素③纠正方法：检验人员严格按照操作规程操作；多次取样；实验前认真检查仪器的分析性能。16、临床生化方法学分级的依据是什么？如何进行分级？各自用途？根据分析方法的准确度与精密度的不同，将实验方法分为决定性方法，参考方法和常规方法。决定性方法：用于发展及评价参考方法和一级标准品。参考方法：应用于鉴定常规方法，评价其误差大小，干扰因素，并决定其是否可以被接受，也用于鉴定二级标准品，为质控血清定值，评价商品试剂盒等。常规方法：作为推荐方法。17、以光度法为例，简述临床生化方法的建立需考虑的因素①方法建立原理的确定：根据技术原理和被测物质的物理化学性质来确定其方法建立的原理②方法建立时条件选择：测定颜色产物的吸光系数—λmax；测定方法适用的浓度范围—选择直线段浓度范围进行稳定性试验；影响颜色反应的因素—pH、杂志、反映的温度和时间、试剂组分浓度18、各个评价试验①重复性试验。目的：检测候选方法的随机误差（精密度）方法：批内重复性试验、天内重复性试验、天间重复性试验②回收试验。目的：所谓回收即分析方法正确测定加入常规分析样品中的纯分析物的能力。目的是检测候选方法的比例系统误差。方法：将被分析物的纯品标准液加入病人样品中成为分析样品院病人样品加入等量的无分析物的溶剂作为基础样品然后用候选方法测定，两者测定结果的差值为回收量③干扰试验。目的：测定候选方法的恒定系统误差。方法：将可能引起干扰的物质配成一定浓度的溶液加到病人样品中称为分析样品，原病人样品加入等量的无干扰物的溶剂作基础样品然后用候选方法测定，两者之差即干扰值表示该干扰物引起的误差④方法比较试验。目的：检测候选方法的系统分析误差。方法：对一组病人的标本用候选方法和对比方法同时进行分析测定最后观察两者之间的差异。数据统计的处理：方法作散点图、进行直线回归分析、作相关分析、配对资料t检验19、何谓临床特异度、灵敏度？都有那些用途？临床特异度又称真阴性率，指在非患病者中，用该诊断试验检查，得到阴性结果的百分率。用途：1拟诊某患者有某疾病的概率较大时，便于确诊2拟诊疾病严重且疗效预后均不好的疾病，以防误诊，尽早解除病人的压力3拟诊疾病严重且根治方法有较大损害时，需确诊以免造成患者不必要的损害。临床灵敏度又称真阳性率，指在患病者中，用该诊断试验检查，得到阳性结果的百分率。用途：1拟诊为严重但疗效好的疾病，以防漏诊2拟诊为有一定治疗效果的恶性肿瘤，以便早期确诊，及时治疗3存在多种可能疾病的诊断，可排除某一诊断4普查或定期健康体检能筛选某一疾病以防漏诊。20、临床诊断试验技术性能评价和诊断性能评价的区别？技术性能评价是评价方法或技术的精密度、准确性、特异性、分析范围等即方法学评价，其解决的是方法本身的问题；诊断性能评价是基于有关流行病学的调查为基础，对某种疾病的诊断方法进行评价的临床试验。即评价该诊断试验的临床灵敏度、临床特异性、预测值、似然比等。21、全面质量控制全面质量控制主要包括一）标本分析前的质量保证：主要内容为①检验人员的培训；实验室的设置和工作环境；实验仪器的质量保证；检测方法的选择和评价；实际和标准品的选择与评价；病人准备；标本的采集处理贮存和转运；实验室用水。二）分析中的质量控制：主要内容建立标准化的操作规程；室内质控和结果分析；登记和填发报表。三）分析后的质量评估：主要内容送发实验报告；室内质控的数据管理；参加室间质量评价；病人投诉的调查；临床信息反馈。22、室内、室间质量控制的概念、目的室内质量控制IQC：是由实验室的工作人员采用一系列统计学的方法连续评价本实验室测定工作是否稳定，判断检验报告是否可发出的过程。目的-检测、控制本实验室测定工作的精密度（监测测定过程是否稳定）并监测其准确度的改变，以提高常规检测结果的一致性。室间质量评价EQA：是多家实验室分析同一样本目的：通过实验室间的对比，观察各实验室测定结果的准确性，一致性，并采取一定措施使各实验室结果趋向一致，，为实验室认可提供客观依据。23、简述ROC曲线的制作方法及其主要作用？ROC曲线的绘制方法：对疾病组和参照组测定结果进行分析、确定测定值的上下限、组距及截断点，按选择的组距间隔列累计频数分布表，计算出所有截断点的敏感性、特异性，以敏感性为纵坐标代表阳性率，（1-特异性）为横坐标作图。ROC曲线的主要作用:选择最佳的诊断界限值，两种或两种以上不同诊断试验对同种疾病诊断可靠性的比较。24、Monica质控图的优点①制作简单，应用方便②形象直观，又容易理解和掌握。③Monica质控图采用统一CCV作为允许误差来确定警告线和最大允许线的界限值，能将临床生化常规项目的室内控制与室间质评有机地联系起来，从室内质控图上，即可基本预测参加室间质评可能获得的变异指数得分情况，更能充分发挥室内控制与室间质控二者之间相互补充，相互促进的作用。1光谱分析技术：指利用各种化学物质（包括原子、基团、分子及高分子化合物）具有吸收、发射或散射光谱谱系的特点，对物质进行定性或定量分析的技术。①分类：根据光谱谱系特征分为吸收光谱分析、发射光谱分析和散射光谱分析。②特点：灵敏度高、精密度和准确度高、选择性较高、仪器设备简单、操作易掌握、用途广泛等。2光的本质是不连续的微粒性和连续的波动性矛盾的对立和统一，即光的波粒二象性。3可采用钨灯做可见光分光光度计的光源（350-2500nm）；氢灯可作为紫外分光光度计的光源（185-400nm）。4分子能级是电子能级、振动能级和转动能级之和。5吸收光谱曲线（吸收光谱）：当一定光源所产生的电磁波通过液态、气态或固态物质时，物质的原子或