第9章真菌及其毒素

第9章真菌及其毒素真菌性食物中毒是指人或动物吃了含有真菌产生的真菌毒素（Mycotoxin）的食物引起的中毒现象。由真菌毒素引起的人或动物的疾病统称为真菌毒素中毒症（Mycotoxicoses）。9.1黄曲霉菌及其毒素9.1.1产毒菌及其特性产毒菌主要是黄曲霉菌该菌属真菌门、半知菌亚门丛梗孢科曲霉属。本菌为需氧菌，最适培养温度30~33℃，相对湿度80~90％。花生、玉米、大米和小麦是其较好的生长基质。寄生曲霉及青霉、毛霉和根霉等真菌也能产生AFT，但产毒量甚微。9.1.2黄曲霉毒素的性质、来源、毒性及在食品中限量标准9.1.2.1黄曲霉毒素的性质黄曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）是黄曲霉（Aspergillusflavus）和寄生曲霉（Aspergillusparasiticus）的代谢产物。目前已发现的AFT有20余种。是一类化学结构类似的化合物，均为二氢呋喃香豆素的衍生物。AFT在紫外线照射下能产生荧光，根据荧光颜色不同，将其分为B族和G族两大类及其衍生物，黄曲霉毒素B1和B2可发出蓝紫色荧光，G1和G2可发出黄绿色荧光。纯净的黄曲霉毒素为无色晶体，耐热，100℃、2h也不能将其全部破坏。可溶于多种有机溶剂如氯仿、甲醇、乙醇等，不溶于水、己烷、乙醚和石油醚。AFT对氧化剂不稳定，如次氯酸钠溶液、氯、过氧化氢、高锰酸钾、漂白粉等均可使AFT分解破坏，并随氧化剂浓度的增大，AFT分解速度加快。人及动物摄入黄曲霉毒素B1和B2后，在乳汁和尿中可检出其代谢产物黄曲霉毒素M1和M2。黄曲霉毒素的化学结构如图9-1所示。OOOCH3OOOOOOCH3OOOOOOCH3OOOOOOOCH3OOOOOOOCH3OOOOHOOOCH3OOOOHB1B2G1G2M1M2图9-1黄曲霉素的化学结构9.1.2.2黄曲霉毒素的来源AFT主要污染粮油食品、动植物食品等。如花生、玉米，大米、小麦、豆类、坚果类、肉类、乳及乳制品、水产品等容易被黄曲霉毒素污染。其中以花生和玉米污染最严重。家庭自制发酵食品也能检出黄曲霉毒素，尤其是高温高湿地区的粮油及制品种捡出率更高。9.1.2.3黄曲霉毒素的毒性及在食品中的限量标准AFT的毒性极强，属于剧毒毒物，毒性比氰化钾大10倍，为砒霜的68倍。其中以B1毒性最大，LD50为0.294μg/kg（口服）。当人摄入量大时，可发生急性中毒，黄曲霉毒素有很强的肝脏毒性，可导致肝细胞坏死、胆管上皮增生、肝脂肪浸润及肝内出血等急性病变。少量持续摄入则可引起肝纤维细胞增生、肝硬化等慢性病变。当微量持续摄人，可造成慢性中毒，表现为生长障碍，亚急性或慢性肝损伤。AFT的致癌力也居首位，是目前已知最强致癌物之一。它的诱癌力是二甲基偶氮苯的900倍以上，比二甲基亚硝胺诱发肝癌的能力大10倍，与人类肝癌有直接的关系。我国和其他许多国家的流行病学调查表明，人群膳食中黄曲霉毒素的水平与原发性肝癌的发生率之间有不同程度的正相关关系，即食品中黄曲霉毒素含量越高，摄入量越多，肝癌的发病率也越高。黄曲霉毒素具有很强的毒性，特别是它的强致癌性，世界各国对于其污染食品的情况都很重视，并对其在食品中含量进行了严格限制，FAO/WHO在1993年提出的指导性标准为：食品中黄曲霉毒素M1≤0.05μg/kg，奶牛饲料中的黄曲霉毒素B1≤5μg/kg。我国于1981年作为正式国家标准，颁布了食品中黄曲霉毒素B1最高允许量标准：玉米、花生仁、花生油为≤20μg/kg；玉米及花生仁制品为≤20μg/kg；大米和其他食油≤10μg/kg；其他粮食、豆类、发酵食品≤5μg/kg；婴儿食品中不得检出。9.1.3黄曲霉毒素的测定黄曲霉毒素的测定方法有多种，主要有薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）和ELISA法等。薄层层析法是国内外测定食品及饲料中AFTB1的主要方法，此法灵敏度较高（1~5ppb），主要用于AFTB1的测定，随后的薄层色谱分离、荧光分光光度计，灵敏度达到（0.1~1.0ppb，甚至高达0.01ppb），可单独测定AFTB1或B2、G1、G2、M1等。近几年采用单克隆免疫亲和柱一高效液相色谱法测定了牛奶中的AFM1，其检出低限达到0.05μg/kg、测定果仁中的AFB1，其检出低限达到0.1μg/kg。2003年，RodrtguezVelascoML等，用ELISA和HPLC法对西班牙里昂农场牛奶中AFTM1的含量进行了检测，这两种检测方法的检测限都为10ng/g，，这两种方法都行之有效。但HPLC法对仪器设备的要求较高，消耗的成本也较高。酶联免疫吸附法（ELISA）测定食品中黄曲霉毒素B1（GB/T5009.22-1996）9.1.3.1主要设备与器材酶标仪（内置490nm滤光片）、酶标微孔板、微量加样器及配套吸头。9.1.3.2试剂1.抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体、2.人工抗原（AFB1-牛血清白蛋白结合物）、3.黄曲霉毒素B1标准溶液：用甲醇将黄曲霉毒素B1配制成1mg/ml溶液，再用甲醇-PBS溶液（20+80）稀释至约10μg/ml，紫外分光光度计测此溶液最大吸收峰的光密度值，代入式（9-1）计算：EfMAX1000（9-1）式中：X——该溶液中黄曲霉毒素B1的浓度，μg/ml；A——测得的光密度值；M——黄曲霉毒素B1的分子量，312；E——摩尔消光系数，21800；f——使用仪器的校正因素。根据计算将该溶液配制成10μg/ml标准溶液，检测时，用甲醇-PBS溶液将该标准溶液稀释至所需浓度。4.牛血清白蛋白（BSA）；5.辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗鼠IgG。6.ELISA缓冲液：（1）包被缓冲液（pH9.6碳酸盐缓冲液）的制备：Na2CO31.59g、NaHCO32.93g加蒸馏水至1000ml。（2）磷酸盐缓冲液（pH7.4PBS）的制备：KH2PO40.2gNa2HPO4·12H2O2.9gNaCl8.0gKCl0.2g加蒸馏水至1000ml。（3）洗液（PBS-T）的制备：PBS加0.05%（V/V）吐温-20。（4）抗体稀释液的制备：BSA1.0g加PBS-T至1000ml。（5）底物缓冲液的制备。甲液（0.1mol/L柠檬酸水溶液）：柠檬酸（C6H8O7·H2O）21.01g，加蒸馏水于1000ml。乙液（0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液）：Na2HPO4·12H2O71.6g，加蒸馏水至1000ml。用前按甲液+乙液+蒸馏水为24.3+25.7+50的比例（体积比）配制。（6）封闭液的制备：同抗体稀释液。9.1.3.3测定原理样品中的黄曲霉毒素B1经提取、脱脂、浓缩后与定量特异性抗体反应，多余的游离抗体则与酶标板内的包被抗原结合，加入酶标记物和底物后显色，与标准比较来测定含量。9.1.3.4步骤1.提取不同食品提取方法各异，以下就主要食品提取过程作简单介绍。（1）大米、小米样品粉碎后过20目筛，称取20.0g，加入250ml具塞锥形瓶中。准确加入60ml三氯甲烷，盖塞后滴水封严。150r/min振荡30min。静置后，用快速定性滤纸过滤于50ml烧杯中。立即取12ml滤液（相当4.0g样品）于75ml蒸发皿中，65℃水浴通风挥干。用2.0ml20%甲醇-PBS分三次（0.8ml、0.7ml、0.5ml）溶解并彻底冲洗蒸发皿中凝结物，移至小试管，加盖振荡后静置待测。此液每毫升相当于2.0g样品。（2）玉米的提取（脂肪含量3.0%～5.0%）样品粉碎后过20目筛，称取20.0g，加入250ml具塞锥形瓶中，准确加入50.0ml甲醇-水（80+20）溶液和15.0ml石油醚，盖塞后滴水封严。150r/min振荡30min。用快速定性滤纸过滤于125ml分液漏斗中。待分层后，放出下层甲醇-水溶液于50ml烧杯中，从中取10.0ml（相当于4.0g样品）于75ml蒸发皿中。以下按（1）自“65℃水浴通风挥干”起，依法操作。（3）花生的提取（脂肪含量15.0%～45.0%）样品去壳去皮粉碎后称取20.0g，加入250ml具塞三角瓶中，准确加入100.0ml甲醇-水（55+45）溶液和30ml石油醚。盖塞后滴水封严。150r/min振荡30min。静置15min后用快速定性滤纸过滤于125ml分液漏斗中。待分层后，放出下层甲醇-水溶液于100ml烧杯中，从中取20.0ml（相当于4.0g样品）置于另一125ml分液漏斗中，加入20.0ml三氯甲烷，振摇2min，静置分层（如有乳化现象可滴加甲醇促使分层）。放出三氯甲烷于75ml蒸发皿中。再加5.0ml三氯甲烷于分液漏斗中重复振摇提取后，放出三氯甲烷一并于蒸发皿中，以下按（1）自“65℃浴通风挥干”起，依法操作。（4）植物油的提取用小烧杯称取4.0g样品，取20.0ml石油醚，将样品移于125ml分液漏斗中，用20.0ml甲醇-水（55+45）溶液分次洗烧杯，再一并移入分液漏斗中（精炼油样品4.0g为4.525ml，直接用移液器加入分液漏斗，加入溶剂后振摇），振摇2min。静置分层后，放出下层甲醇-水溶液于75ml蒸发皿中，再用5.0ml甲醇-水溶液重复振摇提取一次，提取液一并加入蒸发皿中，以下按（1）自“65℃水浴通风挥干”起，依法操作。2.包被微孔板用AFB1-BSA人工抗原包被酶标板，150μL/孔，4℃过夜。3.抗体抗原反应将黄曲霉毒素B1纯化单克隆抗体稀释后分别与等量不同浓度的黄曲霉毒素B1标准溶液用2ml试管混合振荡后，4℃静置。此液用于制作黄曲霉毒素B1标准抑制曲线。再按相同方法配制待测样品。4.封闭已包被的酶标板用洗液洗3次，每次3min，加封闭液封闭，250μL/孔，置37℃下1h。5.测定酶标板洗3×3min后，加抗体抗原反应液（在酶标板的适当孔位加抗体稀释液或Sp2/0培养上清液作为阴性对照）130μL/孔，37℃，2h。酶标板洗3×3min，加酶标二抗（1：200，V/V）100μ/孔，1h。酶标板用洗液洗5×3min。加底物溶液（10mgOPD）加25ml底物缓冲液加37μL30%H2O2，100μL/孔，37℃，15min，然后加2mol/LH2SO4，40μL/孔，以终止显色反应，酶标仪490波长nm测出OD值。6.计算黄曲霉毒素的含量按以下公式（9-2）进行计算。mDVVCgng1)/(B211浓度黄曲霉毒素（9-2）式中：C——黄曲霉毒素B1含量，ng，对应标准曲线按数值插入法求得；V1——样品提取液的体积，ml；V2——滴加样液的体积，ml；D——稀释倍数；m——样品质量，g。由于按标准曲线直接求得的黄曲霉毒素B1浓度（C1）的单位为ng/ml，而测孔中加入的样品提取的体积为0.065ml，所以式（9-2）中C=0.065×C1而V1=2ml，V2=0.065ml，D=2，m2=4g代入式（9-2），则111412065.02065.0)/(CCgngB浓度黄曲霉毒素（9-3）从标准曲线直接求得的数值C1，即为所测样品中黄曲霉毒素B1的浓度（ng/g）。9.2赭曲霉菌及其毒素的检验赭曲霉毒素（Ochratoxin，OTC）在自然界中分布广泛，可寄生在食品、粮食及饲料中并产毒。9.2.1赭曲霉菌毒素的产生菌及其特性赭曲霉毒素的产毒菌有：赭曲霉（Aspergillusochraceus），硫色曲霉（A.sulphureus）、蜜蜂曲霉（A.melleus）及鲜绿青霉（Penicilliumviridicatum）、普通青霉（P.commune）等。一般产毒霉菌在25~28℃，高湿度、阴暗静置条件下培养1~2周产毒较高。9.2.2赭曲霉菌毒素的性质、来源、毒性及在食品中的允许含量标准9.2.2.1赭曲霉菌毒素的性质赭曲霉毒素包括A、B、C（简称OA、OB、OC）等几种衍生物，其化学结构也类似香豆素。OCT是一种相当稳定的化合物，在乙醇溶液中置冰箱保存一年以上不破坏。赭曲霉毒素微溶于水，溶于有机溶剂和稀的碳酸氢钠水溶液（如5％碳酸氢钠）中。在紫外光下OA呈兰绿色荧光，OB呈兰色，OC呈亮绿色。因OCT的分