生物反应器培养干细胞的研究进展强化1301王慧琳1020613114

生化反应器在干细胞培养中的研究进展王慧琳强化1301班1020613114摘要：干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞,在再生医学、药物筛选及毒理学等生物医学领域呈现出诱人的前景。通过目前的干细胞分离培养技术可获得的干细胞数量极少,远远不能满足临床需要,因此体外大规模扩增培养干细胞是亟待解决的问题。该文简述了适用于干细胞培养的各种生物反应器的特点,以及悬浮生物反应器体系在不同类型干细胞群中的研究应用。关键词：干细胞;生物反应器;旋转式生物反应器；间充质细胞；神经干细胞；微载体干细胞是机体内存在的一类未分化的、尚不成熟的特殊细胞,具有自我更新、增殖及多向分化的潜能,在体外可分离、扩增和冷冻保存,且能在适当条件下被诱导分化为不同的组织细胞和器官,具有潜在的再生功能。由于干细胞具有的能够稳定生存增殖并保持多向分化潜能的特性，使其在遗传性疾病和组织器官移植领域有着巨大的应用前景。但是通过目前的干细胞分离培养技术可获得的干细胞数量极少,远远不能满足临床需要,因此体外大规模扩增培养干细胞是亟待解决的问题。神经干细胞(NSCs),是指具有自我更新能力并且能够分化产生三种中枢神经组织细胞一神经元,星型胶质细胞,少突胶质细胞的一种干细胞。它移植入脑后可替代损伤和死亡的神经元,重建神经元回路,并在损伤部位的首端和尾端起中断作用,恢复损伤的脑功能。它为重建受损的神经系统组织、治疗以帕金森症为代表的神经退行性疾病带来了可能,但是,一般情况下,可从供体中获得的干细胞数量是很少的。因此,若要将干细胞推向临床应用化及产业化等实际应用,迫切需要解决的一个问题就是如何在体外大规模扩增这些干细胞,使干细胞产品在量上达到临床治疗的要求。目前,生物反应器(bioreactor)的提出为干细胞培养提供了一种有效的方法,利用生物反应器培养干细胞能实现规模化扩增,并能有效地维持干细胞的未分化特性,进而满足临床上细胞治疗量的要求。动物细胞生物反应器必须要满足低剪切力及良好的气体混合能力这两个特点,具体应考虑如下要求:(1)要有好的生物相容性,能较好地模拟细胞的体内生长环境；(2)提供足够的停留时间,符合过程反应动力学的要求；(3)要满足物质传递的要求；(4)可调控反应过程中的热量,不存在过热点；(5)能有效隔离对细胞有毒性作用的反应物或产物,有良好的抗污染能力；(6)便于操作和维修。生物反应器的早期研究侧重于细胞扩增倍数的放大，近年研究则侧重于3D培养环境对细胞的表面标志物、细胞的增殖能力、分化能力等的影响。选择合适的3D培养方法，能够为细胞创造良好环境，用以保持培养过程中干细胞的特性。1几种生物反应器的介绍1.1滚瓶式生物反应器利用转瓶培养器在不断摇动的细胞培养箱中进行细胞培养。此种方法操作最简单,转瓶培养器具有使用方便、价格低廉等特点。但此种培养体系只适合于贴壁依赖型细胞的培养。1.2搅动悬浮培养生物反应器此种体系设计是最经典、最早被采用的一种生物反应器。通常由罐体、管路、阀门、泵和马达等组成,由马达带动桨叶混合培养液,通过搅拌器的作用使细胞和养分在培养液中均匀分布,罐体上安装的不同传感器在线持续检测培养液的pH、温度、溶氧等参数。此法操作也较简单,既适用于以细胞团块或单细胞形式进行的悬浮细胞培养,也适合贴壁型细胞的微载体培养。但是机械搅动会对细胞造成一定的损伤,死细胞比较多。1.3摇袋式生物反应器装置中,细胞及培养液被置于一个预先消过毒的无菌一次性塑料袋中,通入由除菌过滤器过滤的空气后会形成具有一定空间的培养容器,袋子被置于一个摇动的平台上,随着摇动平台的左右摇动,培养基液体在袋子中形成波浪式的运动,起到良好的混合作用。此种方法通过一次性耗材进行细胞培养,使污染的可能性降到最低,更符合标准化操作的要求,但是操作中细胞的放取及监控细胞培养状态等具有不简便性,同时成本花费比较大。1.4旋转壁式生物反应器旋转壁式生物反应器是目前组织工程领域最为广泛应用的生物反应器。主要由培养室,供应室和半透膜三部分组成。它的主要特点就是培养器在动力带动下绕水平轴或垂直轴旋转,带动容器内培养液和培养物作旋转层流运动,通过气液两相膜进行气体交换,以无菌注射器换液来补充养分。它可为细胞提供一个与体内生长环境非常相似的体外生长环境。另外,由于反应器没有推进器,并且气体是通过渗透膜进入培养室,因此反应器对细胞产生的剪切力较小。而动物细胞由于没有细胞壁,恰恰对剪切力十分敏感,对反应器提供的剪切力要求较高。最后,旋转壁式反应器为细胞生长提供了良好的共培养环境。1.5平板型生物反应器此系统通常由多层平板、中空支架和外壳三部分组成。此种体系可实现细胞的大规模培养,其培养过程中细胞新陈代谢产生的副产物可以随时去除,使其有毒代谢物含量比较低,但是同时细胞培养中产生的分泌性因子也随之减少,对细胞培养也有一定的害处。1.6固定流化床式生物反应器通过3D支架来为细胞的贴壁和生长提供依附,细胞被固定在多孔的载体上,载体固定在中空管中,培养基在管内流动。在此种体系中细胞与细胞间、细胞与基质间的相互作用能更好地模仿生物体内的复杂结构,更有助于细胞的生长。但相比于其他生物反应器,不能进行大规模的扩增细胞。1.7气升式生物反应器它的工作状况柔和,操作简单,有较好的传热、传质和混合特性,培养液的浓度也比较均匀,因此比较适合动物细胞的培养。但气泡上升时产生的涡流以及气泡破裂时产生的瞬间张力将对它附近的细胞产生很大的破坏作用。1.8中空纤维反应器中空纤维反应器由于剪切力小而广泛用于动物细胞的培养。这类反应器由中空纤维管组成,管壁是多孔膜,O2和C02等小分子可以自由透过膜扩散,动物细胞贴附在中空纤维管外壁生长,可以很方便地获取氧分。1.9膜式生物反应器膜式生物反应器主要特点是有一个起传质作用的透析性膜。是一种由半透膜传递营养物质并将细胞分离的生物反应器。它的主要优点是细胞或组织留在反应器内,反应器连续灌流;使用膜包埋技术,这是比较温和的一种方法,这对于培养容易受到剪应力破坏的动物细胞是很合适的,加上它可以降低血清的使用量,又能连续长时间无菌操作,因此被认为最有希望应用于人体组织的培养。由于膜的通透性限制，不适用于动物细胞高浓度培养。2旋转壁式生物反应器的应用2.1旋转壁式生物反应器培养间充质干细胞间充质干细胞（MSCs)是中胚层来源的具有定向分化能力的干细胞,主要存在于全身结缔组织和器官间质中,以骨髓组织中含量最为丰富,胎儿脐血中亦可分离得到。间充质干细胞在一定的诱导条件下具有向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、肌键细胞、成肌细胞以及基质细胞等中胚层分化的能力,同时间充质干细胞还可以向外胚层的神经元细胞和内胚层的肝卵圆形细胞分化。间充质干细胞(MSCs)是典型的贴壁依赖型细胞。该细胞只有黏附在固体基质表面才能够增殖。微载体为MSCs提供贴壁环境，支持细胞的大量增殖。微载体培养系统具有显著优势:(1)同时兼具单层培养和悬浮培养，且是均相培养；(2)细胞所处环境均一；(3)具有较高表面比；(4)环境条件容易测量监控；(5)操作可系统化、自动化，降低了污染发生的机会。微载体的产品很多，基本可分为实心微载体和大孔微载体两类。实心微载体:实心微载体易于细胞在微球表面贴壁、铺展和病毒生产时的细胞感染。是一种由葡聚糖机制表面交联变形凝胶的实心圆形微粒，它可以同细胞紧密链接，由此被广泛应用于贴壁细胞的培养中。实心微载体比表面积较小，细胞易受搅拌、球间碰撞、流动剪切力等动力学因素破坏。而大孔微载体弥补了这样的缺点。大孔微载体是一种用于大规模高密度动物细胞培养的支持物，其内部具有网状结构的小孔，细胞可在其内部生长，降低血清用量，增加细胞固定化稳定性，增大比表面积，又可避免细胞遭受机械损伤。用旋转壁式生物反应器进行细胞培养主要具有如下特点:(1)低剪切力对细胞无机械损伤,膜式氧合气进行气体代谢,清除气泡防止涡流产生,物流转移率高,从而改善离体细胞的培养条件；(2)细胞在旋转壁式生物反应器中有一定程度的三维空间自由,有利于细胞-细胞、细胞-基质之间按组织学特性相互接触,有利于细胞间的信号转导。目前可以成功应用生物反应器进行MSCs的培养和定向分化。下面是一个骨髓间充质干细胞在旋转壁式生物反应器中培养的应用实例：一、细胞形态：接种后120h后，生物反应器内细胞在微载体上的生长形态图接种后120h后，静态培养状态下细胞在微载体上的生长形态图从以上两图可以看出，部分细胞贴附在微载体上,之后细胞在微载体上扩增,且通过细胞基质黏附在一起,有搭桥现象；而在静态培养条件下细胞黏附在微载体的周围,微载体呈分散分布。这说明,骨髓间充质干细胞在旋转壁式生物反应器中培养时,细胞借助于该系统所提供的三维生长环境大大的提高了细胞之间获取联系的机会,相对于传统的静态培养显示出很大的优势。二、兔骨髓间充质干细胞的生长曲线细胞在生物反应器中扩增了10倍而在静态培养中仅扩增了3倍。细胞在旋转壁式生物反应器中扩增的倍增时间远远小于在培养瓶内培养的倍增时间,而比生长速率也明显高于后者。这也说明三维培养环境由于与体内微环境相似而更适合细胞在体外的培养。三、兔骨髓间充质干细胞扩增倍数比较兔骨髓间充质干细胞在旋转壁式生物反应器的三维动态培养条件下,细胞一代的扩增倍数为9.6,而在静态培养下其扩增倍数为3.1。由此可见,由于生物反应器为细胞提供了更接近于体内的三维生长环境,相对于静态培养中的二维生长环境,生物反应器更适合骨髓间充质干细胞在体外的扩增。四、营养物质代谢：对于葡萄糖,随着培养时间的增长,旋转壁式生物反应器培养体系中营养物质浓度呈平稳下降的趋势,说明细胞在不断地消耗营养物质而进行分裂增殖。同样在乳酸的比较中,旋转壁式生物反应器培养体系中细胞代谢的乳酸量不断增加并且在很长的一段时间内高于静态培养中的。这些结果说明旋转壁式生物反应器内兔骨髓间充质干细胞的新陈代谢活动旺盛。这可能是由于培养基的不断循环及培养室内流体的旋转层流运动,使得生物反应器内的养分供应充足、均匀,反应器内的传质性能优越,因而间充质干细胞在旋转壁式生物反应器内生长代谢活跃。五、小结：旋转壁式生物反应器内培养的骨髓间充质干细胞显示了较好的生长状态、扩增能力和细胞活性,并且其内的骨髓间充质干细胞的扩增倍数多于静态培养中的扩增倍数。2.2旋转壁式生物反应器培养神经干细胞一、神经干细胞生长曲线旋转壁式生物反应器内的神经干细胞增殖的更快一些。这可能是因为旋转壁式生物反应器内流体的层流运动以及培养基的不断循环混合,使细胞分裂增殖信号快速而有效的在培养室内传递,从而导致细胞的快速增殖。二、神经干细胞倍增时间比较：旋转壁式生物反应器中细胞倍增时间远小于在T形瓶中培养细胞的倍增时间，说明细胞在旋转壁式生物反应器内具有更旺盛的生命力，这是由于相比于T型瓶中静态的二维生长环境,旋转壁式生物反应器为细胞生长提供了更加接近自然生长状态的三维生长环境,使得细胞处于积极的分裂增殖状态。因此旋转壁式生物反应器在培养神经干细胞方面显示了优越的潜能。三、营养物质代谢：对于葡萄糖,随着培养时间的增长,旋转壁式生物反应器培养体系中营养物质浓度呈平稳下降的趋势,说明细胞在不断地消耗营养物质而进行分裂增殖。同样在乳酸的比较中,旋转壁式生物反应器培养体系中细胞代谢的乳酸量不断增加并且在很长的一段时间内高于T形瓶中的。这些结果说明旋转壁式生物反应器内神经干细胞的新陈代谢活动旺盛。这可能是由于培养基的不断循环及培养室内流体的旋转层流运动,使得生物反应器内的养分供应充足、均匀,反应器内的传质性能优越,因而神经干细胞在旋转壁式生物反应器内生长代谢活跃。四、小结：旋转壁式生物反应器是一种理想的神经干细胞体外培养的三维体系。其内生长的神经干细胞有较好的生长状态、扩增能力和细胞活性,并且神经干细胞的扩增倍数略多于T一Flask中的扩增倍数,倍增时间远小于T--Falks中的倍增时间。同时,免疫荧光化学法、诱导分化以及染色体数目和核型分析分另d从不同角度证实了旋转壁式生物反应器培养的神经干细胞的干细胞特性良好,遗传特性稳定。3结束语目前,生物反应器已成为大规模培养