生物学系统实验介绍及实验安排.

生物科学专业系统实验（3）——微生物学专业实验任课教师：程立忠13888812282王绍辉13888336373实验过程的首要问题——实验安全首先注意自身的安全问题，学会保护自已。注意避免水、电、化学药品等造成的伤害。注意仪器使用过程出现的危险和损害。实验室内部的安全——防火、防水、防盗等。出现问题不要惊慌，冷静处理，不隐瞒。本门实验课开设的目的进一步利用已具备有的实验技能，系统综合解决实验过程中的问题立足于多动手多训练，加强自主性加强实践性教学和创新意识的培养实验完成后能够达到一定自主解决实验过程遇到的问题的能力（包括其它研究中所涉及的问题），可以完成一些研究性实验工作初步积累一定自主实验的经验。实验课所涉及的命题及安排拟以α-淀粉酶细菌菌株的选育为目的；建立研究平台，在教师指导下让学生完成相关系统实验；实验内容将涉及微生物学的最基本研究方向，包括微生物的培养、发酵、生理学、生物后提取、生物化学分析等；用到的技术主要有微生物纯化分离技术、发酵培养技术、电泳技术、酶提取及纯化技术及相关生化分析技术；整个实验时间相对固定，过程中有灵活安排（具体再商定——充分利用晚上）；实验分组情况及组织安排本门实验课分为若干组，每组2~4人；自行组合，相互密切配合，完成试验内容，多动手，认真总结并完成实验报告；实验过程中的一些物品、试剂、样品等，因为下次实验还需要请自行保管好（连续过程）；相关试剂不够用，请和教师联系配制；完成实验后由本班次负责人安排值日生进行相应的卫生打扫和公共物品整理；注意：实验时间可能远远超过72学时。实验考核成绩评定平时成绩（占20分）实验习惯（占10分）实验报告（占30分）考核及考试（占20分）按组答辩（占20分）科学研究工作需要解决和注意的一些问题研究目的的确立——区分基础研究和应用研究；研究内容和方法的建立——很多时候是一种开创性的工作；检测手段的解决——高效、专一、准确；数据结果的分析——从表观现象揭示内在的联系和结果；不要怕出错或忽视和自已的预见不符的结果——认真分析，创新发现。本门实验课的具体内容1.从土壤中分离产淀粉酶的菌株——分离纯化、检测、筛选培养（初筛和复筛）（3周完成）。2.产酶发酵条件的优化研究（3~4周完成）。3.酶的提取纯化及电泳检测分析（粗提、纯化）（分批次4~5周完成）。4.酶生物学特性研究（3~4周完成）5.水解及产物分析实验（1~2周完成）注意：实验内容涉及较多，实验过程中遇到的未定因素较多，经费时间有限，这些可能造成相关实验内容完成有困难，各组之间最终结果要求不定——注重过程和训练目的。从土壤中分离产淀粉酶的菌株⑴分离步骤和方法——分离用培养基、检测方法，从土壤中分离得到一株产淀粉酶的菌株（以细菌为主）⑵对已有菌株进行相应产淀粉酶初发酵研究，得到最初产酶发酵水平（包括初筛和复筛两部分）。产酶发酵条件的优化利用产酶的培养基成分及培养条件，利用正交设计优化产酶发酵条件结果将结合相关的分析统计软件进行统计分析研究，获得优化条件酶的提取及电泳检测分析⑴在产酶高峰期，收集发酵液，制备粗酶液⑵利用相应的蛋白质提取技术，沉淀酶蛋白，得到粗酶粉⑶利用柱层析系统，分离提纯酶蛋白⑷各步骤利用蛋白电泳技术检测酶蛋白的纯度，及酶蛋白的分子量。酶生物学特性研究利用已纯化的酶蛋白，并进行相应的酶学特性研究最适pH值的测定最适温度的测定热稳定性的测定相关金属离子等物质的影响测定Km及Vmax的测定水解及产物分析实验⑴利用自己分离纯化的酶制品，水解淀粉得到葡萄糖（水解材料可以自选），并测定其转化率⑵通过薄板层析等手段进行一定酶产物分析研究，并介绍有关仪器分析方面的知识⑶介绍相关的生物分析知识相关参考书目1.沈萍范秀容李广武主编微生物学实验高等教育出版社2.林稚兰黄秀梨主编现代微生物学与实验技术科学出版社3.宋大新范长胜徐德强等主编微生物学实验技术教程复旦大学出版社4.东秀珠，蔡妙英主编常见细菌系统分类和鉴定方法科学出版社5.焦瑞身周德庆主编微生物生理代谢实验技术科学出版社6.贾盘兴蔡金科等编著微生物遗传学实验技术科学出版社7.诸葛健王正祥编著工业微生物实验技术手册中国轻工业出版社8.汪家政范明主编蛋白质技术手册科学出版社9.苏拔贤主编生物化学制备技术科学出版社10.颜子颖王海林译F·奥斯伯R·布伦特R·E·金斯顿等著精编分子生物学实验指南11.徐继初主编生物统计及试验设计农业出版社12.李春喜王志和王文林编著生物统计学（第二版）科学出版社513.黄海罗友丰陈志英等编著SPSS10.0forWindows统计分析人民邮电出版社14.微生物学报微生物学通报食品与发酵等相关期刊杂志实验α-淀粉酶活力测定方法介绍酶活力单位测定的介绍测定的目的——纯化不容易；纯化过程中容易失活——质量（重量）不能用于定量；酶活力和酶活性的差别酶活力反应的实质——催化反应速度高低酶活力单位的定义及表示——增加可比性国际标准（25℃、1min、1umol）实际应用的标准酶活力的测定方法单位时间内底物的减少量或产物的增加量反应完一定量底物的时间长短测定物的要求：可测性、反应的专一性、稳定性、简便性比酶活力的定义——1mg酶蛋白的酶活力（有时用1g表示）测定过程中的条件控制——温度、pH等酶活力测定的方法碘比色法（有相应的国家标准）在一定反应条件下，1小时转化1g淀粉变为糊精的酶量定义为1个酶活力单位3，5-二硝基水杨酸比色法（DNS法）在一定反应条件下，1分钟反应生成1mg麦芽糖的酶量定义为1个酶活力单位注意：去除β-淀粉酶的干扰医学上的一些测定方法（专用试剂盒，通过生化仪器反应测定，需要微量快速）对微生物酶发酵研究中的一些问题进行讨论标准曲线制作的问题（配制所需测定物质的梯度浓度）酶的诱导问题（微生物长期适应进化的结果）酶发酵中氮源问题（蛋白质合成的一些问题）酶的合成中能量问题（需要消耗大量的能量）摇瓶发酵中的容量问题（三角瓶，250、500ml）发酵中的溶解氧问题缓冲液的配制问题在α-淀粉酶发酵培养基中CaCl2的使用问题在摇瓶发酵中非可溶性物质的加入问题化学分析中基准物的处理（纯度、结晶水的处理——不稳定）相关概念的介绍复壮——狭义的复壮仅是一种消极的措施，指的是在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生长性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚在未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施；而广义的复壮则应是一项积极的措施，即在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状的测定工作，以期从中选择到自发的正变个体。相关概念的介绍菌种活化——使保藏的菌种（休眠状态）恢复到最佳生长状态（包括一些菌种性能的恢复），生长状态的均一化（相对）。一般包括：斜面活化（平板划线形成单菌落）；液体摇瓶培养；种子培养（针对大规模工业生产）相关概念的介绍种子培养基：营养成分相对丰富，一般无限制性因子，有利于菌体的增殖，生长好；发酵培养基：营养成分有利于积累所需代谢产物，一般在培养基有一些限制性因子（包括培养条件）。注意：种子培养基接种于发酵培养基时，注意微生物生长延滞期（有一定营养成分重叠）。实验室摇瓶机（摇床）的作用使培养基一直保持均匀状态——菌体始终接触到新的营养成分（相对来说）；快速稀释代谢废物（一般对细胞有毒害作用，对人类来说可能有用）增加培养基中溶解氧的浓度，提高菌种的有氧代谢强度，加快物质的转化，有利于代谢产物的合成和积累。摇瓶机的种类旋转式——转速相应较高（200转以上），培养液贴壁旋转；往复式——转速不易太高，一般120转/分左右，培养液来回振荡，振荡液面较高；往复式的溶氧效果较好（相对旋转式）；注意摇瓶机的振幅（偏心距）。摇瓶发酵试验时三角瓶装量的要求一般要求装液量为三角瓶标注容量的1/10~1/5如500ml三角瓶经常加入50~100ml（常装50ml或100ml）；如250ml三角瓶经常加入25~50ml（常装50ml）；注意：根据需要可以特制（如加挡板，增加溶解氧）。培养过程温度的保持空气浴——通过加热空气来保持培养空间的温度，相对简单，实验室设计空间可大可小，精度低（±0.5~1℃），传热慢；水浴恒温——通过加热水恒温器皿内的溶液，一般设计空间较小（实验室科研用的较多），精度高（±0.1℃），传热快。缓冲溶液（Buffersolution）能够缓冲由于加酸或加碱而使溶液H+浓度（pH值）改变的溶液（也是其主要作用）；另一个作用是可以在溶液浓缩或稀释时而不改变溶液的pH值（或影响很小，10倍以内）[HA]][AlgpKapH用于生物学实验的缓冲剂的要求不能透过生物膜；生物学稳定性以及不干扰新陈代谢和生物学过程；对紫外线和可见光无明显吸收；离子成分或盐浓度对实验的影响极小；温度对其pH值的影响极小。配制系列浓度稀释液的方法线性稀释——稀释液的浓度梯度是相同的（0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0……）；对数稀释（倍数稀释）——系列溶液的浓度比是一常数，取决于稀释梯度——2倍稀释（1、1/2、1/4、1/8……）；10倍稀释（1、1/10、1/100、1/1000……）；调和浓度稀释——系列溶液的浓度为连续排列整数的倒数（1，1/2，1/3，1/4，1/5……）。缓冲液的配制方法单独配制相关药品的溶液，根据所需配制缓冲溶液的pH值、体积，量取一定体积混合而成；根据所需配制缓冲溶液的pH值、体积，计算药品的用量，称取后溶解定容；以一种所需药品为主体（一定浓度），用pH计检测滴加相应酸或碱调节至所需pH值后，再定容。菌种斜面菌种活化（18~24hr）液体摇瓶活化（18~24hr）接种摇瓶发酵培养（2%，48~72hr）液体菌种活化培养基（种子培养基）可以利用微生物实验书的淀粉培养基，注意调节pH值；也可以利用发酵培养基（豆粕粉需要煮水后使用）；发酵培养基可溶性淀粉8g；豆粕粉4g；Na2HPO4.12H2O0.8g；（NH4）2SO40.4g；CaCl20.2gNH4Cl0.15g；水100ml121.3℃灭菌20分钟如果还想使用自已组的设计培养基，可以以上述培养基作为对照（不一定所有菌株都做，选择好的）培养接种需发酵测定的菌种活化培养液，1mL/瓶（接种量2-5%，实验前后统一）。37℃，摇瓶振荡培养2-3天。α-淀粉酶酶活力测定的原理底物（反应物）为淀粉产物为麦芽糖、糊精等酶活力测定（碘比色法——目视）酶活力定义：在60℃下1小时内将1克淀粉转化为糊精的酶量称一个酶活力单位（5~10分钟反应完成）。淀粉及糊精检测原理：碘检测淀粉（紫蓝色，30分子以上）→红色糊精（红棕色，7-30分子）→无色糊精，7分子以下）→麦芽糖（不显色）→葡萄糖（不显色）计算公式：)/(485.0%22060mLtNNt酶活力单位酶活力测定步骤发酵液（酶液）2%淀粉液20mL+5mLpH6.0缓冲液预热5min（60℃）预热5min（60℃）吸取0.5mL混匀、计时（保温60℃），反应开始在白瓷板上定时取样（1滴）比色比色终点，计下反应时间（与标准比色管颜色相同）代入公式计算酶活力单位1mL标准糊精液＋3mL标准稀碘液混匀标准比色管（红棕色）对照比色确定反应终点酶活力测定（DNS比色法）酶活力定义：在一定反应条件下，1分钟反应生成1mg麦芽糖的酶量定义为1个酶活力单位。注意：去除β-淀粉酶的干扰。检测的原理：酶解的产物之一——麦芽糖具有还原性，可以使试剂中的3，5-二硝基水杨酸还原，形成红色的物质，在550nm下有吸收峰，并和浓度呈一定线性关系。计算公式：根据标准曲线计算3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂配制说明21g氢氧化钠（先加入溶解）；182g酒石酸钾钠（同上）；6.3gDNS（3，5-二硝基水杨酸），加热完全溶于上述溶液中；5g重蒸苯酚（冷却后加入）；5g无水亚硫酸钠（冷却后加入）；完全溶解后定容至1000ml，贮存时间越长越稳定。引自朱俭，曹凯鸣，周润琦，蔡武城，袁厚积编著．生物化学实验．上海：上海科学技术出版社，1981．酶活力测定步骤1ml酶液加热15min（70℃）