生物技术制药复习

1.生物技术：以生命科学为基础，利用生物体（或生物组织、细胞及其组分）的特性和功能，设计构建具有预期性状的新物种或新品系，并与工程相结合，利用这样的新物种（品系进行加工生产，为社会提供商品和服务的一个综合性技术体系。基因工程是生物技术的核心与关键，细胞工程是生物技术的基础，酶工程是生物技术的条件，发酵工程是生物技术获得最终产品的手段。2.生物技术药物：一般来说，采用DNA重组技术或者其他生物新技术研制的蛋白质或者核酸类药物，称为生物技术药物。3.生物技术制药的特征：1高技术2高投入3长周期4高风险5高收益4.逆转录法1、mRNA的纯化2、cDNA第一链的合成3、cDNA第二链的合成4、cDNA克隆5、将重组体导入宿主细胞6、cDNA文库的鉴定7、目的cDNA克隆的分离和鉴定5.表达载体必须具备以下条件：1载体能独立地进行复制2应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，3应具有很强的启动子4应具有阻遏子5应具有很强的终止子6所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号6.影响目的基因在大肠杆菌中表达的因1外源基因的剂量2外源基因的表达效率3表达产物的稳定性4细胞的代谢负荷5工程菌的培养条件7.分批培养：是指在一个密闭系统内投入有限数量的营养物质后，接入少量菌种进行培养，使菌种生长繁殖，在特定条件下完成一个生长周期的微生物培养方法。一般为了获得高密度菌体，需要将溶氧控制和流加补料相结合，延长对数期；补料分批培养：间歇或连续补加培养基使菌体进一步生长；连续培养：菌体浓度达到一定程度后，开动进料和出料泵，以一定的稀释率不间断培养；透析培养：利用膜的半透性原理使培养物和培养基分离，以去除代谢产物产生的不利影响；固定化培养：将工程菌固定化后再进行连续培养。8.细胞破碎：物理破碎法：高压匀浆，高速珠磨，超声破碎，高压挤压；化学破碎法：渗透冲击，增溶法，脂溶法；生物破碎法：酶溶法9.离子交换层析是以离子交换剂为固定相，依据流动相中组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时结合力的大小差别进行分离的方法疏水层析是利用蛋白质表面疏水区域与固定相上疏水基团相互作用力的差异进行分离的方法。亲和层析是利用固定化配体与目的蛋白之间非常特异的生物亲和力进行吸附，这种吸附既是特异的，又是可逆的，改变条件可以使这种结合解除。凝胶过滤层析又称排阻层析，是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小对各组分进行分离的层析方法：比孔径大的不能扩散入孔径内部，先流出；较小的分子深入孔径内部，洗脱时间长，最后流出；分子大小适中的流出时间中等。10.贴壁细胞：生长须有贴附的支持物表面，自身分泌或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长。悬浮细胞生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长。如淋巴细胞，Namalwa细胞，细胞呈圆形。兼性贴壁细胞生长不严格依赖支持物，既可以贴附于支持物表面生长，也可以在培养基中呈悬浮状态良好的生长。11.动物细胞的生理特点1细胞分裂周期长2细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象3正常二倍体细胞的生长寿命是有限的4对周围环境十分敏感5动物细胞对培养基的要求高6动物细胞对蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同12.CHO-K1：从中国地鼠卵巢中分离的上皮样细胞。广泛使用的是缺乏二氢叶酸还原酶的营养缺陷型突变株CHO-dhfr-。培养时需加入脯氨酸。核型：2n=20～22。培养基：DEME培养基+0.1mmol/L次黄嘌呤+0.1mmol/L胸苷+10%小牛血清。生产的重组药品有：组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)，红细胞生成素(EPO)，乙肝表面抗原疫苗，粒系细胞集落刺激因子G-CSF，凝血因子VIII等。WI-38：来源于女性高加索人正常胚肺组织的二倍体细胞系.该细胞是成纤维细胞，能产生胶原;培养基:BME（Eagle’sbasalmedium）加小牛血清，pH控制在7.2。细胞的倍增时间为24h，有限寿命为50代，最早被认为安全的传代细胞，上世纪60年代被广泛用于制备疫苗。13.培养成功必备条件：1所有与细胞接触的设备、器材和溶液，都必须保持绝对无菌，避免细胞外微生物的污染2必须有足够的营养供应，绝对不可有有害的物质，避免即使是极微量的有害离子的掺入3保证有适量的氧气供应4需要随时清除细胞代谢中产生的有害产物5有良好的适于生存的外界环境6及时分种，保持合适的细胞密度14.天然培养基指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基，早期阶段使用较多，如血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸液以及羊水、腹水等。缺点：成分复杂，制作过程复杂，组分不稳定，批间差异大，来源有限，不适于大量培养和生产的需要，逐渐为合成培养基所替代。合成培养基优点：成分明确，组分稳定，可大量生产供应①氨基酸：是细胞合成蛋白质的原料。所有细胞都需要12种必需氨基酸，此外还需要谷氨酰胺。②维生素：主要是形成酶的辅酶、辅基，维持细胞生命活动的低分子活性物质。脂溶性（A、D、E、K），水溶性维生素（C、B1、B2、B12、生物素、叶酸、胆碱）等都是常用的成分。③糖类:培养中的细胞可以进行有氧与无氧酵解，六碳糖是主要能源。此外六碳糖也是也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。细胞对葡萄糖的吸收能力最高，半乳糖最低。④无机盐：保持细胞的渗透压，缓冲pH的变化，并积极参与细胞的代谢。细胞生长除需Na、K、Ca、Mg、N、P等基本元素，还需要Fe、Cu、Zn、Mn等微量元素。⑤其它成分：核酸前体（ATGCU核苷酸）氧化还原剂（谷胱甘肽）动物血清（5-10%小牛血清）15.血清的作用①提供有利于细胞生长增殖所需的各种生长因子和激素②提供有利于细胞贴壁所需的贴附因子和伸展因子③提供可识别金属、激素、维生素和脂质的结合蛋白④提供细胞生长所必需的脂肪酸和微量元素⑤提供良好的pH缓冲系统16.悬浮培养：即让细胞自由地悬浮于培养基内生长繁殖。适用于一切种类的非贴壁依赖性细胞（悬浮细胞）也适用于兼性贴壁细胞。优点：操作简便，培养条件比较单一，传质和传氧较好，容易扩大培养规模，在培养设备的设计和实际操作中可借鉴细菌发酵的经验；可连续收集部分细胞进行移植继代培养，传代时无需消化分散，免遭酶类、EDTA及机械损害；细胞收率高，并可连续测定细胞浓度，还有可能实现大规模直接克隆培养。缺点：细胞体积较小，较难采用灌流培养，细胞密度较低贴壁培养：必须让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养方法。适用于一切贴壁依赖性细胞，也适用于兼性贴壁细胞。优点：适用的细胞种类广，较容易采用灌流培养缺点：操作麻烦，需要合适的贴附材料和足够的面积，传代或扩大培养时需先消化，培养条件不易均一，传质和传氧较差。与悬浮培养的另外不同是在传代或者扩大培养时需要用酶将其从基质上消化下来，分散成单个细胞再培养。贴壁-悬浮培养（假悬浮培养）为了将上述两类培养方法的优势相互结合，能够形成更理想的适合工业化大规模生产的培养方法：微载体培养法：将动物细胞吸附于微载体表面，在培养液中进行悬浮培养，使细胞在微载体表面长成单层的培养方法，或称微珠培养法。优点：既可创造相当大的贴附面积供细胞贴附生长增殖，满足绝大多数细胞的基本要求，又由于载体体积很小，比重较轻，在轻度搅拌下即可携带细胞自由悬浮在培养基内，充分发挥了悬浮培养的一切优点。包埋和微囊培养包埋法：将细胞包埋于琼脂、琼脂糖、胶原及血纤维等海绵状基质中微囊法：由包埋法衍生而来，将包埋的颗粒经液化处理而成为微囊1包埋或微囊培养法的优点：包埋或包裹在载体或微囊内的细胞可获得保护，避免了剪切力的损害。2可以获得较高的细胞密度，一般都在107-108个/ml以上。3当控制微囊膜的孔径后，可使产品浓缩在微囊内，从而有利于下游产物的纯化。4可采用多种生物反应器进行大规模培养，如搅拌式，气升式或者固定床式生物反应器。结团培养利用细胞本身作为基质，相互贴附后，再用悬浮的方法培养，可获得高密度的细胞。优点：操作简便，节省了用于微载体的成本缺点：用量小，细胞不能在载体上伸展，细胞呈球形。17.动物细胞培养的操作方式分批式操作1将种子细胞和培养基一次性加入反应器内进行培养，此后细胞不断增长，产物不断形成和积累，最后将已含有细胞产物的培养基，或连同细胞一并取出，培养结束。2先将细胞和培养基加入反应器，待细胞生长至一定密度后，向反应器内加入诱导剂或病毒等，经一段时间作用后，将反应物取出。半连续式操作定义：当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，取出部分培养物，或单纯是条件培养基，或连同细胞、载体一起，然后补充同样数量的新鲜培养基，或另加新鲜载体，继续培养。优点：操作简便，生产效率高，可长期进行生产，反复收获产品，而且可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。灌流式操作定义：当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部分条件培养基取出，同时不断地补充新鲜培养基。但细胞留在反应器内，使细胞处于一种不断的营养状态。与半连续培养不同的是，只取出部分条件培养基，而绝大多数细胞仍保留在反应器内。优点：细胞可处在较稳定的良好的环境中，营养条件好，有害代谢废物浓度低；可极大地提高细胞密度，从而极大地提高了产品产量；产品在罐内停留时间缩短，可及时收留在低温下保存，有利于产品质量的提高；反应速率容易控制，培养周期较长，可提高生产率，目标产品回收率高。18.盐析：溶液中加入无机盐类，破坏蛋白质分子周围的水化膜，使蛋白质溶解度降低而析出。透析：蛋分子较大，不能通过半透膜，可以据此将蛋白质与相对分子质量白质较小的杂质分开。将盐析出的蛋白质置于透析袋内，透析袋外面放置蒸馏水，可以除去盐分子。19.抗体是指能与相应抗原特异性结合具有免疫功能的球蛋白单克隆抗体由一个抗原决定簇刺激的、单一的B细胞和骨髓瘤细胞融合增殖后所产生的、高度均一的抗体。20.常用的选择性培养::HAT培养基。原理：培养基中含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶(T))，由于氨基喋（A）能阻断DNA合成的主要途径(D途径)，而在S途径中需要次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶((hgprt))的帮助才能完成合成，而所用的骨髓瘤细胞基本上都是hgprt缺陷株，因此瘤-瘤融合细胞和瘤细胞因不能合成DNA而死亡。脾-脾融合细胞和未融合的瘤细胞在培养几天后也迅速死亡（死亡原因？），而杂交瘤细胞则可以存活。21.小分子抗体的制备原因和制备原理为了减少抗体的鼠源性，降低抗体的分子量，使其在不改变活性的前提下能穿透实体组织，人们开发了以下几种抗体：人--鼠嵌合抗体改形抗体Fab和Fv单链抗体单域抗体最小识别单位双功能抗体和多功能抗体22.噬菌体展示1目的基因的获得2导入噬菌体3建立表面展示4淘筛5选择阳性克隆表达23.抗体诊断血清学诊断中使用的抗体制剂血清学鉴定是指用已知抗体来鉴定未知的抗原型，用于疾病的病原菌诊断，癌胚抗原测定，妊娠免疫诊断和血型鉴定。常用的方法是凝集。优点：简单快速，应用广泛，普及至基层免疫标记用的抗体试剂根据标记不同，分为三类标记技术：免疫荧光技术，免疫酶技术，放射免疫技术。导向诊断药物在体内直接诊断病原的抗体试剂被称为导向诊断药物放射免疫显像优点：①在体内确切肿瘤定位作用，准确性达90%，灵敏度达100%。②在体内可检出0.5cm大小的病灶，并可检出肺脑的转移灶。③小分子抗体易到达肿瘤部位，可显著提高N/NT值④抗体在肿瘤部位可保留6～9日⑤能观察抗体在血中的半衰期和可能出现的不良反应24.抗体治疗药物：以抗体为载体的导向治疗药物。其应用上的障碍是抗体相对分子质量大，穿透力低，不能到达靶部位或其摄取量低；另外就是鼠源性单克隆抗体的排斥反应。目前正致力于抗体小型化和人源化的研究。①放射性同位素标记的抗体治疗药物放射性同位素标记肿瘤特异性抗体，以抗体作为导向载体，导向病灶，利用放射性同位素的电离辐射能量治疗病灶，使肿瘤细胞接受最大的电离辐射能量，杀伤肿瘤细胞。优点：操作简便，同位素和抗体的用量小，且能观察到药物在体内的分布和药物动力学，就用前景好。缺点：有些同位素来源困难，且需放射性保护和污物处理。②与抗癌药物耦联的抗体治疗药物③与毒素耦联的