甲基化实验步骤

一．重亚硫酸盐修饰基因组DNA的制备采用EZDNAMehtylation-GoldKitTMD5005试剂盒，按照操作说明书分别对提取的Blank、Cya基因组DNA进行重亚硫酸盐修饰。1.分别吸取10μLBlank和CyaDNA样品到PCR管中，加入10μL水补足20μL，每个样品加130μLCTconversionreagent。轻弹管子或者用枪吹打混匀，离心使液体沉到管底。2.将管子放到热循环仪中，运行以下步骤：1.98℃10min2.64℃2.5h3.4℃保存可至20h3.加600μLM-BindingBuffer到Zymo-SpinTMICColumn,柱子放在提供的收集管中。4.把样品（来自步骤2）加到装M-BindingBuffer的Zymo-SpinTMICColumn中。盖上盖子，颠倒混匀。5.全速离心（≥10000g）30s。倒掉流穿液。6.加100μLM-WashBuffer到柱子上。全速离心30s。7.加200μLM-DesulphonationBuffer到柱子上，室温（20℃-30℃）静置15-20min。孵育完成后，全速离心30s。8.加200μLM-WashBuffer到柱子上。全速离心30s。另加200μLM-WashBuffer，再离心30s。9.把柱子放到1.5mL离心管。垂直加10μLM-Elutionbuffer到柱子基质。全速离心30s洗脱DNA。二．PCR扩增反应模板：重亚硫酸盐修饰的Blank、Cya基因组DNA引物上游：CTCAAGCTTCGAATTTTTTTATAAGAAGAAGATATAG下游：TAGATCCGGTGGATCAAAACTCCACCACAAACCACTT目的片段长度：476bp1.操作步骤：反应体系模板0.5μL10×KODplusbuffer5μLdNTPSMixture（2.5mMeach）5μLMg2+4μL上游引物3μL下游引物3μLDMSO4μLKODplus酶2μLddH2O23.5μLTotal50μL反应条件：1）95℃3min2）95℃25s；48℃15s；72℃45s。35Cycles3）72℃10min；4℃∞。电泳将上述50μLPCR产物与10μL6×LoadingBuffer混匀，经1%琼脂糖凝胶电泳：125V，25min；凝胶图像分析系统观察结果，拍照。结果：MBlankCya目的片段切胶回收按照AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒说明书回收目的片段。1.在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，计算凝胶重量，该重量作为一个凝胶体积。2.加入3个凝胶体积的BufferDE-A，混合均匀后于75℃加热，间断混合，直至凝胶块完全熔化。3.加0.5个BufferDE-A体积的BufferDE-B，混合均匀。4.吸取步骤3中的混合液，转移到DNA制备管中，12000×g离心1min。弃滤液。5.将制备管置回2mL离心管，加500μLBufferW1,12000×g离心30s，弃滤液。6.将制备管置回2mL离心管，加700μLBufferW2,12000×g离心30s，弃滤液。以同样的方法再用700μLBufferW2洗涤一次，12000×g离心1min。7.将制备管置回2mL离心管中，12000×g离心2min。8.将制备管置于洁净的1.5mL离心管中，在制备膜中央加25μL加热至65℃的去离子水，室温静置1min。12000×g离心1min洗脱DNA。三．重组1.YFPC1质粒EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切将抽提好的YFPC1质粒按以下步骤进行双酶切。反应体系：EcoRⅠ1μLBamHⅠ1μLYFPC1质粒5μL10×K2μLH2O11μL20001000750500250100共4管反应条件：37℃2h酶切完成后，4管合成2管，1%琼脂糖凝胶检测，结果正确。切胶回收。2.连接采用GenaCopoeiaFast-FusionTM克隆试剂盒。反应体系：YFPC1双酶切产物5μL目的片段3μL10×ClonaseBuffer1μLFast-FusionTMClonase1μL轻弹管壁使配置好的反应液分散均匀。25℃温育15min。冰上保存直至转化。四．转化1.从-80℃冰箱取出大肠杆菌DH5α感受态细胞悬液，室温解冻，解冻后立即置于冰上。2.将重组产物全部加入感受态中，轻弹混匀，冰上放置30min。3.42℃水浴中热击90s，热击后迅速置于冰上冷却3-5min。4.向管中加入800μL无抗LB液体培养基，混匀后摇床37℃，200rpm培养1h。5.菌液5000rpm离心5min，倒掉上清，混匀，均匀涂于LB（K+抗性）平板，37℃培养箱培养过夜。五．摇菌测序分别挑取Blank、Cya组20个转化子，3mLLB（K+抗性）培养基37℃摇床200rpm过夜培养。菌液送测序。