电子显微镜岳希洁.

电子显微镜显微镜的历史大约在400年前（1590年），由荷兰科学家杨森和后来的博物学家列文虎克发明和完善的显微镜，向人们揭示了一个陌生的微观世界，他们是开辟人类显微分析的始祖。早期的显微镜因为早期的显微镜以玻璃镜片做透镜，使用可见光为光源，所以人们把它称为光学显微镜。现在，最好的光学显微镜可以达到1500倍的放大倍数。现代的光学显微镜在光学显微镜的完善和发展过程中，人们发现：不管如何完善光学显微镜的透镜和结构，其放大倍数和分辨率总是被限定在1000多倍和几百纳米的水平，不可能再有所新的突破。后来，人们终于发现：是显微镜所使用的光源限制了光学显微镜的放大倍数和分辨率的进一步发展。因为，可见光的波长在390纳米到760纳米之间，而显微镜的分辨率最多也只能是其所使用光源的半波长的大小，所以光学显微镜的理论极限分辨本领也就在200纳米左右。关于显微学的一些基本概念分辨率放大与空放大聚焦，欠焦与过焦景深什么是分辨率？简单地说，分辨率就是能够把两个点分辨开的最小距离。人眼睛的分辨率大约为0.1个毫米。所以，要想看清比0.1个毫米还小的东西，就要借助于放大镜和显微镜。即利用显微镜把所要观察的物体至少放大到0.1个毫米以上，我们才能看清它。不同波长光源分辨本领的比较放大与空放大定义：对于某一显微镜而言，在其可分辨能力之内的图像放大，叫做有效放大。此时的图像放大不失图像表面的细节。而在显微镜分辨能力以外的图像放大，叫做空放大，也叫做无效放大。空放大只是放大了图像的轮廓，而不能放大和分辨图像表面的细节。聚焦和景深的概念聚焦：简单地说就是让图像最清楚。在理论上讲，就是让成像在透镜的焦点上。欠焦：就是成像还未达到焦点。过焦：就是成像已超过了焦点。景深：就是在焦点附近能看清图像的余量。一般在低倍率下景深较大，在高倍率下景深变小。光学焦距图既然是光源限制了显微镜的放大倍数和分辨率的发展，人们自然会想到：要想提高显微镜的放大倍数和分辨率，就应该更换波长更短的光源。随着人们对电磁波的认识，人们了解到：在一定的电压下电子束的波长可以达到零点几个纳米，使用电子束做为光源，显微镜的分辨率就可能提高几个数量级。电子显微镜的产生电磁透镜研究发现：静电磁场可以使电子的运动方向发生改变，对称的静电磁场可以像玻璃聚焦光线那样把电子束汇聚成一点，这使得用电子束聚焦成像成为可能，这样就产生了电磁透镜。由于电磁透镜能把电子束象光一样地聚焦成像，所以使用电子束做为光源的显微镜就应运而生了。这就是电子显微镜。实用的电子显微镜经过不断的实验和摸索，在上个世纪三十年代，由德国科学家M·克诺尔与E·鲁斯卡在柏林工学院制造出了世界上第一台透射式电子显微镜。由于使用了电子束做为显微镜的光源，电子显微镜的分辨率大大超过了光学显微镜，达到了零点几个纳米的水平。加速电压与电子束波长的关系电子显微镜的电子束波长视其所使用的加速电压的大小而定，一般加速电压在100KV的电子显微镜其电子束的波长约为0.4纳米，这样电子显微镜的分辨率应该可以达到两个埃(0.2纳米）的水平，这要比光学显微镜的分辨率高的多的多。超高压的电子显微镜其电子束的波长更短，所以会有更高的分辨率。超高压电子显微镜电子显微镜的分类电子显微镜基本分为两种类型：一种是：透射电子显微镜，另一种是：扫描电子显微镜。透射电镜是透射成像，图像是二维的。扫描电镜是反射成像，图像是三维的，有很好的立体感，但分辨率低于透射电镜，目前指标分辨率可以达到3个纳米。1、透射电子显微镜（TEM）透射电镜即透射电子显微镜（TransmissionElectronMicroscope，简称TEM），通常称作电子显微镜或电镜（EM），是使用最为广泛的一类电镜。工作原理：在细胞生物学上，可用于观察和研究细胞内部的亚显微镜结构、蛋白质、核酸等生物大分子的形态结构及病毒的形态结构。透射电子显微镜以电子枪作为照明光源，从电子枪灯丝发射的电子束经聚光镜会聚照射到样品上。带有样品结构信息的透射电子（transmissionelectrons，TE）进入成像系统，被各级成像透镜聚焦、放大后，投射在观察荧光屏上，形成透射电子显微镜像。主要优点：分辨率高，可用来观察组织和细胞内部的超微结构以及微生物和生物大分子的全貌。透射电镜的结构：主要由照明系统、样品室、成像系统、真空系统、观察与记录系统、电源及电器系统等六部分组成根据加速电压的大小分为以下3种：（1）一般TEM。最常用的是100KV电镜。这种电镜分辨率高（点0.3nm，晶格0.14nm），但穿透本领小，观察样品必须很薄，约为30～100nm，如细胞和组织的超薄切片、复型膜和负染样品等。（2）高压TEM。目前常用的是200KV电镜。这种电镜对样品的穿透本领约为100KV电镜的1.6倍，可以在观察较厚样品时获得很好的分辨本领，从而可以对细胞结构进行三维观察。（3）超高压TEM。目前已有500KV、1000KV和3000KV的超高压TEM。这类电镜具有穿透本领强、辐射损伤小、可以配备环境样品室及进行各种动态观察等优点，分辨率也已达到或超过100KV电镜的水平。在超高压电镜上附加充气样品室，使人们可以观察活细胞内的超微结构动态变化。透射电镜下根尖细胞的亚显微结构2．扫描电镜（SEM）扫描电镜即扫描电子显微镜（ScanningElectronMicroscope，简称SEM）。主要用于观察样品的表面形貌、割裂面结构、管腔内表面的结构等。扫描电镜原理人类红细胞依据性能不同主要分为：（1）一般SEM目前一般扫描电镜采用热发射电子枪，分辨率为6nm左右，若采用六硼化镧电子枪，分辨率可提高到4～5nm。（2）场发射电子枪SEM由于场发射电子枪具有亮度高、能量分散少，阴极源尺寸小等优点，这种电镜的分辨率已达到3nm。场发射电子枪SEM的另一个优点是可以在低加速电压下进行高分辨率观察，因此可以直接观察绝缘体而不发生充、放电现象（3）生物用SEM这种SEM备有冰冻冷热样品台，可把含水生物样品迅速冷冻并对冰冻样品进行观察，可以减少化学处理引起的人为变化，使观察样品更接近于自然状态。如要观察内部结构，还可用冷刀把样品进行切开，加温使冰升华，并在其上喷镀一层金属再进行观察，所有这些过程都在SEM中不破坏真空的状态下进行。3．电子探针电子探针主要用于探测微小区域的元素成分。其原义仅是一个物理学名词，意指聚焦了的电子束。当电子束照射样品表面时，可激发X射线，X射线光量子的能量及波长与元素的原子序数有关，称为特征X射线。采用晶体分光光谱法测定X射线的波长和强度来分析样品成分的仪器，称为X射线分光光谱仪或电子探针；用锂漂移硅探头测定X射线能量和强度的仪器称为X射线能谱仪。扫描隧道显微镜及原理扫描隧道显微镜图片硅表面纳米算盘由单个原子构成的“IBM”4．分析电镜分析电镜是利用电子射线轰击样品所产生的X射线或俄歇电子对样品元素进行分析的一类电镜。其特点是能在观察超微结构的同时，对样品中一个极微小的区域进行化学分析，从而在超微结构水平上测定各种细胞结构的化学成分及其变化规律。（1）分析TEM。在TEM上配备X射线能谱仪后即成为分析TEM，目前很多100KV和200KVTEM都可以装上X射线检测附件，进行样品的元素分析。（2）分析SEM。在SEM上配备X射线能谱仪后，便可兼有电子探针分析样品化学成分的功能。（3）扫描俄歇电镜。把SEM与俄歇电子能量分析仪相结合，即成为扫描俄歇电镜，它能对样品表面进行微区元素分析，是一种表面微观分析电镜。5．扫描透射电镜SEM中电子射线作用于样品后，其中一部分电子可透过样品成为透射电子，将透过样品的透射电子和散射电子用检测器接收成像，即成为扫描透射电镜。这种电镜一般用场发射电子枪，兼有TEM、SEM和分析电镜的特点，能观察较厚的样品，分辨本领和成像质量都很好，是近年来电镜技术的最大改进之一。使用电子显微镜的一般要求由于电子显微镜镜体内为真空系统，所以要求被分析物质应为干燥的，不含有水分或挥发性溶剂的样品。对于透射电镜还要求被分析样品要做的很薄，最好在100纳米以下，以有利于电子束的穿透成像。当加速电压较高时，电子束的穿透力会更强，所以样品可以做得厚一些。透射电镜的制样目的制样目的：就是要使样品做的很薄，以利于电子束的穿过。制样方法：可以是粉碎；切片；研磨；减薄；分散，以及复型或染色等等。制样使用的设备有：超薄切片机；真空镀膜机；离子减薄仪等等。样品制备的具体要求和方法对于粉末样品一般要求粒度应小于300纳米，粒度较大时，会只能看到颗粒的轮廓，不能分析颗粒表面上的细节。纤维类样品得直径应最好小于200纳米。不论是纤维，粉末或高分子纳米球的样品都要在适当的溶液中做良好的分散，然后滴在或捞到铜网上的支撑膜上。对于特殊样品需要做特殊的制备，列如：切片，染色，离子减薄或复型处理。铜网和承载样品的支撑膜透射电子显微镜使用的铜网一般直径为2毫米，上面铳有许多微米大小的孔，在铜网上覆盖了一层很薄的火棉胶膜并在上面蒸镀了碳层以增加其膜的强度，被分析样品就承载在这种支撑膜上。如果在连续的火棉胶膜上再制出一些通透的孔，我们把这种支撑膜叫作“微筛”。高分辨分析时一般使用微筛来承载样品。什么是染色？对于反射电子能力差，图像衬度小的样品常用染色的方法来提高成像的质量。染色的目的就是让被分析样品结合上一些重金属，以增加其反射电子的能力，使样品成像的衬度变大，最终获得高质量的电镜照片。染色常常是对于生物样品或高分子样品而言的，染色的方法有许多种，对于不同的样品其染色方法可能完全不同。无机粉末样品的制备要求首先，样品的粒度要足够的小，例如在100纳米以下。如果有团聚较大的颗粒，要适当的做研磨处理。一般将粉末样品置于无水乙醇之中，使用超声波将其充分分散，然后再滴到微筛膜上，自然凉干后就可用于电镜分析了。电镜照片的分析对电镜照片的分析，应先从各种资料中尽可能地对被分析样品有所了解，估计可能出现的结果，再与电镜照片进行比对，做出正确的解释。对于金属氧化物可能具有一些典型的构成形状，如球形，条形，支形或核形等等，可以根据这些形状来判断金属氧化物的种类和生长情况。现代电镜一般都带有“能谱”附件，对于不好判断的晶粒形状，可以使用X光能谱对所分析的样品做分区元素分析，然后再做出其正确的判断。典型电镜照片的比较金颗粒三氧化二铁单晶，多晶与非晶的比较使用电镜的电子衍射功能可以判断样品的结晶状态：单晶为排列完好的点阵。多晶为一组序列直径的同心环。非晶为一对称的球形。单晶，多晶与非晶的电子衍射图一些样品的电镜照片Ni晶粒催化剂表面Co颗粒球表面的Au，氧化镧，Fe2O3Zn粒，Al2O3，单壁碳管氧化膜，碳管组装，银粒生长样品表面的凹凸形态和附着物电镜使用中的一些问题放大倍数不是越大越好。要搞清你做电镜分析的目的。不是什么样品都能达到分辨率的指标。要获得高质量的电镜照片，样品制备是一个重要的因素。好的设备，加上适当的样品处理和精心的操作才能得到高水平的电镜分析结果。电子显微镜以其超高的分辨率而优于光学显微镜，使其广泛地应用于材料，医学，化学，生物等诸多的领域，它已经成为现代科学研究必不可缺少的科研工具。但是，电子显微镜由于它特殊的系统结构，使其在使用上也有一定的限制，例如：它不能像光学显微镜那样可以直接地观察液体样品，所以它在样品制备方面有着一些特定的要求，我们需要根据不同的样品采取不同的制样方法，以适合于电镜分析的要求，最终达到良好的电镜分析目的。谢谢！