第三章分光光度计

第三章分光光度计分光光度计和光电比色计的工作原理相同，都是利用物质对不同波长的光选择性吸收的现象，对物质进行定量及定性分析的仪器。第一节分光光度计的类型分光光度计也有多种分类方法。按工作波长范围不同来划分，分光光度计分为红外分光光度计、紫外分光光度计和可见（光）光分光光度计三类。其中的紫外分光光度计均兼有可见光分光光度计的功能。按待分析物质对光的吸收性质不同，可分为分子吸收光分光光度计和原子吸收分光分光光度计两类。上述的红外、紫外和可见分光光度计均属于分子吸收分光光度计。按待分析物质对光的作用效果来分，可分为发射光谱类分光分光光度计和吸收光谱类分光光度计两大类。在医学上应用的发射光谱类分光光度计主要有荧光(分光)光度计和火焰(分光)光度计两类。分子吸收光分光光度计和原子吸收分光分光光度计都属于吸收类分光光度计。本节主要介绍基层医院最常用的721及722型两种可见（光）光分光光度计。第二节可见分光光度计的原理及结构一、工作原理吸收式分光光度计都是根据物质对不同波长的光具有选择性地吸收的特点而进行工作的，它们都以朗伯-比尔定律作为定量依据。当一束平行的、特定波长的单色光照射到有色溶液后，该有色溶液就会对光产生吸收。溶液的浓度越大，对光的吸收越多。其吸收程度符合朗伯-比尔定律。即T＝（Ｉt／Ｉ0）100%Ａ＝－lgＩt／Ｉ0＝ＫＣＬ式中：Ｔ为透射比。Ｉt为透过光的强度。Ｉ0入射光的强度。Ａ为吸光度。也叫消光度或光密度。Ｋ为吸收系数。Ｃ为溶液的浓度Ｌ为溶液的厚度。朗伯-比尔定律（Ａ＝ＫＣＬ）说明：当一束光通过有色溶液后，溶液的吸光度A与溶液的浓度C及液层厚度L成正比。吸光度A与溶液的透射比T成负对数关系。比色分析时，溶液的透射比T很容易测量出来。通过对透射进行负对数计算，可以得到吸光度值。再将吸光度除以相应的系数，便可求出待测溶液的浓度。二、基本结构一般的可见分光光度计由光源、单色器、比色皿、光电转换器、前置放大器、对数放大器、显示部件及电源电路组成。如图3-2-1所示。图中的虚线部分也可以没有。图3-2-1分光光度计基本结构图图中各部分的作用如下：光源灯发出的复合光经单色光器后，变为单色光。此单色光通过比色皿时，被比色皿中盛放的样品液吸收掉一部分，然后照在光电转换（检测）器上。光电转换器将照在它上面的光信号的强弱转变为电信号的大小。这一信号与溶液的透射比T成正比。此信号经前置放大器后，可以直接送到显示器将溶液的透射比显示出来。由朗伯-比尔定律可知，溶液的吸光度与透射比的负对数成正比。要想线性地显示吸光度A，必须经过负对数放大后才行。透射比经（负）对数放大器进行放大，变为吸光度A。吸光度A可直接送到显示器显示，也可再经过一个简单的浓度调节电路后，显示溶液的浓度值C。721型分光光度计没有图中虚线部分的电路。其吸光度A不能线性显示（也不能直接读取浓度）。所以其表头上的吸光度刻度是非线性的。下面将各部件作较详细的介绍。（一）光源灯可见分光光度计的光源灯通常为钨丝灯和卤钨灯两种。前者的体积较大、寿命较短。并且随使用时间的延长，发光强度会慢慢变弱。卤钨灯可克服上述缺陷。这两种灯能产生从近紫外（320nm）到近红外（2500nm）之间的光谱。其发光稳定性与所加的电压有关。（二）单色器单色器又叫单色光器。其作用是把复合光分解成分析时所需要的单色光。其分光方式有棱镜式和光栅式两种。棱镜式分光的方式比较落后。近代分光光度计都采用光栅分光。光源灯产生的光通过单色器后，被分解成红橙黄绿青蓝紫的光谱带。投照在出光狭缝的内壁。改变波长调节装置，棱镜或光栅的角度随之变化，其分解后的光谱便在狭缝内壁移动，所需要的单色光便从狭缝中透出来。与此同时，波长显示装置出将所调节的波长显示出来。（三）比色皿比色皿有多种称呼：如比色杯、比色槽、比色池、吸收池、测量池等。其作用是用来盛装比色溶液。可见光区使用的比色皿都用光学玻璃制成，它只能用于可见光区。不能在紫外分光光度计上使用。比色皿有5mm、10mm、20mm、40mm等多种规格。其中10mm是最常用的标准规格。大于10mm用于溶液过稀的场合，小于10mm用于溶液过浓的场合。（四）光电检测器光电转换器又叫光电检测器，是用来将光能转换成电能的器件。分光光度计所使用的光电检测器均采用线性转换器件。常用的光电检测器的类型有光电池、真空光电管、光电倍增管以及半导体光电二极管、光敏电阻等。721型和722型分光光度计使用的光电检测器都是真空光电管。为了防止电磁信号及杂散光的干扰，光电检测器通常都是和前置放大器一起，单独放在一个光电管暗盒中。（五）前置放大与对数放大光电检测器转换成的电信号，通常先送到前置放大器，经前置放大器放大到足够大以后，显示器光源灯单色器比色皿光电转换前置放大对数放大浓度调节电源电路TTTAAC再送到显示装置。如前所述，前置放大后的信号与溶液的透射比T成正比。只有将透射比Ｔ作负对数放大后，才能线性地显示吸光度A。（六）浓度调节电路浓度调节电路通常由电位器组成。在比色皿中放入已知浓度的标准溶液后，调节浓度调节电路，使仪器显示其浓度值。而后，才能进行浓度测定。最简单的分光光度计如721型，信号经前置放大后直接送到磁电式表头进行显示，仪器没有对数放大及浓度调节电路。表盘上的吸光度刻度为非线性的对数刻度。（七）显示装置可见分光光度计常用的显示装置有磁电式表头及数字式表头两种。（八）电源电路电源电路用于产生光源灯所需要的稳定电压及仪器放大电路所需要的其他直流电压。复习题：1.分光光度计按波长分类有哪几种？最常用的是哪一种？2.一台分光光度计基本组成有哪些？3.分光光度计常用的分光器件是什么？4.分光光度计使用对数放大器的目的是什么？第三节721型和721A型分光光度计（上海第三分析仪器厂生产）国内从20世纪70年代就开始生产721型分光光度计。此同一型号的仪器国内有多个厂家生产。几十年来各厂家产生的721分光光度计，除了光路部分较少变化外，其他部分则不尽相同。如除了指针式读数外，还有采用数字表头读数的721A型。721A型将显示部分改为数字表头显示，电路部分增加了对数放大器，可以线索性地读取吸光度，还可以读取浓度。其他部分变化不太大。一、技术指标波长范围：360nm～800nm。波长精度：（360～600）nm±3nm，（600～700）nm±5nm，（700～800）nm±8nm。波长重复性：相应波长准确度的一半。透射比准确度：2.5%透射比重复性：0.5%暗电流稳定性：0.5%光电流稳定性1.5％。电源电压变化范围：220V±10%仪器尺寸：506mm×345mm×200mm仪器净重：17kg二、面板介绍仪器的外观如图3-3-1所示。波长读数盘指示表头比色皿暗盒盖电源开关试样室拉杆电源指示灯波长调节钮0点调节钮100%调节钮灵敏度选择开关图3-3-1721型分光光度计的外形三、721型分光光度计的使用方法仪器经过运输和搬运等原因，可能会造成波长及吸光度的准确度发生变化。再加上分光光度计属于国家强制检定项目，所以，分光光度计在使用前，应经过计量单位检定，只有计量检定合格，且在计量有效期内的仪器才能使用。使用本仪器前，应该仔细阅读该机的使用说明书，了解各个操作旋钮之功能。在未接通电源之前，应该对仪器的安全性进行检查。在确信电源线接线正常、接地良好、各个调节旋钮的起始位置正确后，再接通电源开关。此外，应先检查旋在仪器底部的两个硅胶干燥筒。正常时，筒内的硅胶应为蓝色。受潮后，会变成淡粉色。发现硅胶变成淡粉色后，应予以更换或者将硅胶烘干到蓝色后再使用。否则，可能引起仪器工作不正常（如显示不稳，调“0％”，调“100％”不能到位等）。仪器的使用步骤如下：1．在仪器未接通电源时，电表的指针必须位于“0”刻线上。若不是这种情况，应卸下仪器上盖板，调节电表上的校正螺丝，使表头指在“0”位。2．将灵敏度旋钮调至“1”挡。此时，仪器的放大倍数最小，稳定性最好。3．调节仪器波长旋钮，调至所需波长处。4．打开试样室盖，开启电源。调“0％”旋钮，使电表指示“0”。盖上试样室盖，调“100％”旋钮使电表指示100附近。若调不到“100”，可调节灵敏度钮，增加灵敏度挡数。打开试样室盖，将仪器预热20分钟。5．在试样室盖打开的情况下，再次调节0％旋钮，使电表指示“0”。6．将装有参比溶液及样品液的比色皿放置于比色架中。参比液放一份，样品液可以放置三份。参比液通常放置于最前或最后位置。注意，比色皿外壁的液体一定要擦拭干净，否则，会造成大的测量误差。7．盖上试样室盖，将装有参比溶液的比色皿（有时以空气作参比）拉或推入光路，调节“100％”旋钮，使电表指示“100”。如果调不到“100”，则可适当增加灵敏度挡数。上述“调0”及“调100”步骤应反复调节两三次。8．将装有被测溶液的比色皿依次推或拉入光路中，然后，从指示表头上读出被测量溶液的透射比T或吸光度A值，并将其记录下来。四、721A型分光光度计的使用方法1．将灵敏度旋钮调至“1”挡。2．调节仪器的波长钮，即将波长置于测试所需的波长处。3．打开试样室盖，开启电源。将选择开关置于“T”挡，调“0％”旋钮，使数字显示“00.0”。然后，盖上试样室盖，调“100％”旋钮，使数字显示在“100.0”附近。若调不到“100.0”，则可适当增加灵敏度挡数。打开试样室盖，对仪器预热20min。4．20min后，在打开试样室盖的情况下，调节“0％”旋钮，使数字显示为“00.0”。5．将装有参比和待测溶液的比色皿放置于比色架中。6．关上试样室盖，将装有参比溶液的比色皿（有时以空气作参比）置于光路中，调节“100％”旋钮，使数字显示为“100.0”。如果显示不到“100.0”，则可适当增加灵敏度挡数。上述“调0”及“调100”即“4”与“6”两步骤应反复调节两三次。7．将被测溶液置于光路中，从显示器上直接读出被测溶液的透射比（T）值。并将其记录下来。8．吸光度（A）的测量：当进行完上述第（6）步后，即当仪器的数字显示为“100.0时，将选择开关置于”挡，旋动吸光度调零旋钮，使得数字显示为“.000”，然后移入被测溶液，表头示值即为试样的吸光度（A）值。9．浓度（C）的测量：将选择开关由“A”旋至“C”，将已标定（知道）浓度的溶液移入光路中。调节浓度旋钮，使得数字显示为标定值。然后，将被测溶液移入光路中，显示器上的读数即为所测溶液的浓度值。五、721型分光光度计使用注意事项1．在能使参比液调到“100”的情况下，尽可能采用灵敏度较低的挡。在低挡时，仪器有更高的稳定性。所以使用时一般先放置在“1”挡，灵敏度不够时再逐渐升高。改变灵敏度后必须重新校正“0”和“100”。2．在大幅度改变波长或大幅度旋转“100％”旋钮后，需等待片刻后才能正常工作。因光能量急剧变化，光电管及钨丝灯均需一段响应平衡时间。3．根据溶液含量的不同，可以酌情选用不同光径长度的比色皿，目的是尽可能使电表读数或数字显示处于（0.2～0.8）A吸光度值内。在这一区域内的读数更准确。4．本仪器还配有0.5A、1A及1.5A三块中性滤光片。这三块滤光片是在测量浓度过高的溶液时用的。例如，在测定吸光度为1.7A左右的溶液时，我们在电表指示上易造成过大的读数误差（721型）或数字显示吸光度值不稳（721A）。如果在测定时，在参比溶液处再加放一块1A的中性滤光片，则电表读数（721）或数字（721A）为0.74A，则实际值为1.74A。但是，要注意的是：这三块滤光片只是粗略的标称值。具体到在每个波长下的值或你需要的波长下的值是多少，都是未知数。使用前，需要在计量合格的更高一级的分光光度计上确定其数值后，才能这样使用。否则，有可能会引起更大的误差。5．取放比色皿时应拿其磨沙面，并经常检查所用的同一套比色皿是否配套正常。检查方法是：在比色皿中放入相同的溶液，在相同的波长下测量，测出的透射比误差不大于0.5%。否则，应对比色皿进行清洁处理。处理后若仍有不合格者，应将其剔除，不能再使用。需要注意的是，每个仪器的比色皿都是配套的，不能和其他仪器的比色皿单独调换。6．