灯盏花乙素靶向调控NOX2-ROS-CX43信号通路治疗脑缺血再灌注损伤的作用机制研探索

综述灯盏花乙素靶向调控NOX2-ROS-CX43信号通路治疗脑缺血再灌注损伤的作用机制研探索摘要：在大脑缺血再灌注的损伤中，其中氧化反应是引发损伤的重要机制，活性氧（Reactiveoxygenspecies，ROS）的清除是脑损伤治疗的研究重点，而脑血管ROS的主要来源为NADPH酶（NOX），在脑缺血损伤中最相关的是NOX2，抑制NOX2可明显减少脑缺血损伤。临床发现灯盏花乙素（Scutellarin）来源于灯盏花素，能够对抗自由基，改善脑缺血-再灌注的损伤，改善神经功能评分，减少脑梗死面积和脑水肿，而CX43在此通路中是一个重要的传递因子，在脑血管损伤中，CX43的表达增加。对此，本文就灯盏花乙素清除自由基-NOX2下调-ROS减少-CX43增加，从而改善脑缺血再灌注损伤的机制做一个综述。关键词：脑缺血再灌注；灯盏花乙素；NADPH氧化酶；活性氧研究意义：世界卫生组织统计中风的患病率达1500/年，死亡率高达550万/年，永久致残率达500万/年【1,2】我国中风的发病率远远高于西方国家，并且呈现出高死亡率、高复发率、高致残率的特点，成为严重威胁我国国民生命健康的重大社会问题[3]。而目前大量临床资料显示，脑栓塞后4.5小时内唯一有效的治疗方法便是使用tPA（丝氨酸蛋白酶组织型纤溶酶溶栓激活剂），但该方法仍有缺点，一是治疗时间窗短，二是引起溶栓后大脑的再灌注损伤。不幸的是，这些临床患者的疗效效果仍然不佳。【4】因此，研究局灶性脑缺血后神经元死亡的有效药物及机制，为阐明脑缺血损伤的重要机制及研发理想的神经保护干预策略提供了最根本的理论基础。脑缺血再灌注的损伤机制中，是一个多环节，多因素，多途径损伤的酶促级联反应，过程复杂，往往单一机制的研究是不能达到满意的效果，而中药，在大量临床及研究表明，可以通过多途径作用于多环节来实现治疗的效果，并且取得了一定的成效，但其中进一步生物机制仍不明确。灯盏生脉胶囊是临床上大量用于治疗脑梗等缺血性脑损伤疾病的中成药，临床灯盏花含黄酮，可扩张血管，对抗垂体后叶素所致缺血、缺氧作用，且能抗凝、改善微循环、降低血黏度；具有较强的活血化瘀、散寒、舒筋、止痛等功效。同时，治疗后脑梗死体积明显缩小，提示灯盏花素具有缩小梗死灶面积。【5】而其中最主要的成分是灯盏细辛，而灯盏花乙素（Scutellarin）是从灯盏细辛中提取的主要黄酮类活性成分之一。【6】近年来研究表明灯盏花乙素对脑血管的损伤具有保护作用。【7-12】它能增加局部的血液灌注，在心脑血管，从而改善供血，减缓损伤。因此，我们认为“灯盏花乙素-清除自由基-NOX2下调-ROS减少”，从而保护及改善脑缺血损伤这一理论机制，一方面，有利于探索脑缺血发病机制的探索和更好的为临床服务，另一方面，可以为其他黄酮类化合物在脑保护作用研究方面，提供重要参考。国内外研究现状及分析：急性缺血性脑卒中后，部分脑血管缺血，该血管供应的组织缺血缺氧，损伤，这时，通过溶栓药物或机械取栓的干预措施，引起溶栓血管的出血和水肿，称为“再灌注损伤”。[13]目前临床上主要的治疗策略是溶栓药物或机械性取栓【14】，其最大的副作用损伤就是再灌注损伤。因此，减少再灌注损伤，会使更多的患者获利。研究表明，刘宏等通过化学发光检测结构显示灯盏花乙素对羟自由基，超氧阴离子和过氧化氢均有良好的清除作用，且呈现明显的量效关系，提示其治疗缺血性心脑血管疾病的机制之一是活性氧ROX（Reactiveoxygenspecial）清除作用【11】；卢晓梅等研究发现灯盏花素对缺血再灌注小鼠ＭＭＰ-９有显著的抑制作用并降低血脑屏障的通透性,其机制可能为灯盏花素是ＰＫＣ的抑制剂、转录因子如ＥＩＳ－１ＨＩＦ－１等由ＰＫＣ活化后激活，从而调控与胶原合成降解有关的ＭＭＰｓ的表达降低ＭＭＰs和血脑屏障通透性，减轻对脑组织的损伤【12】；也有学者提出灯盏花乙素能明显减少脑缺血再灌注后梗死面积，其保护作用可能和Cx43相关。但氧自由基被认为是这种损伤的主导因素，生物体在进行氧化还原反应的过程中伴有ROS的产生，正常生理条件下ROS的生成与清除处于一种动态平衡，一定量的自由基水平有利于维持生物体正常功能。但在脑缺血再灌注时，通过磷脂酶的钙激活、黄嘌呤氧化酶、Fenton和Haber-Wei反应等途径产生过多的活性氧，如果细胞内的氧清除能力不足则会因蛋白质、脂质和DNA分子的过氧化反应而导致其结构和功能的破坏，从而造成细胞、组织的病理改变[15]。此外，浸润缺血组织或进入缺血血管的免疫细胞通过各种酶系统也可以产生活性物质，活性氧在脑缺血再灌注造成脑损伤、脑水肿及细胞死亡等病理过程中起着重要的作用[16]。活性氧引起的过氧化反应是缺血性脑损伤发生的重要机制,抗氧化治疗一直是中风治疗的研究重点，但是近年来的研究热点开始靶向ROS的来源，而不是ROS本身[17]。无论是生理条件下还是在缺血再灌注的病理条件下，脑血管ROS的主要来源为NADPH氧化酶（NOX）[17]。NOX，经典地被认为仅仅是一种外周吞噬酶，参与杀死细菌，真菌，微生物，目前被看做是中枢神经系统绝大多数疾病ROS的主要来源,NOX有七种同系物，Nox1–5以及双氧化酶Duox1，Duox2，分别按它们膜结合的催化亚基来命名。实验研究发现抑制NADPH氧化酶或基因敲除NADPH氧化酶的亚型减少了再灌注过程中产生的超氧化物的量，减少了再灌注损伤，这种干预方式不仅可以治疗脑缺血，而且与溶栓剂或机械溶栓相结合可以减少血管再通治疗的并发症[17]。NOX2，又名GP91PHOX（糖蛋白91的吞噬氧化酶），研究证明在体外培养海马神经元缺糖缺氧模型，抑制NOX2明显减少了ROS的产物[18]。体内也有研究证实通过NOX2药理抑制剂对缺血性脑损伤起保护作用[19-25]。灯盏花素，主要成分是灯盏花乙素，化学名为4'，5，6三羟基黄酮-葡萄糖醛酸苷，结构如下：OOHOOHHOOOHOHHOHOHHHHOOC黄酮类化合物清除ROS的活性基团是酚羟基，其主要机理是其酚羟基通过提供氢原子，与ROS发生氧化还原反应而发挥作用。灯盏花乙素C环的C2、C3的双键能与C4的羰基形成共轭，这种共轭的形成有利于稳定灯盏花乙素与ROS反应生成的酚自由基，从而增强其抗氧化活性，C2、C3双键的饱和将会导致抗氧化活性的下降[26]。黄酮类化合物A、B环上取代羟基的数量与其抗氧化活性成正相关，灯盏花乙素在A、B环上共有三个取代羟基，且在A环的G和C6为邻二酚羟基结构，这种邻二酚的结构同样能使其所形成的自由基共振形成邻苯醌，两种因素均有利于稳定灯盏花乙索与ROS反应所形成的自由基[27]。Guo研究认为β-淀粉肽神经毒性导致大鼠脑的过氧化应激，炎症及凋亡能够被灯盏花乙素所减弱[8]，该课题组的研究还证实灯盏花乙素能够保护缺血缺氧引起的脑损伤是通过增强抗过氧化防御能力来实现的[9]。Zhang的研究团队证实灯盏花乙素对缺血损伤所诱导凋亡的保护作用可能与PARP所依赖的线粒体功能障碍以及随后的AIF的易位有关系[10]。由此，由过氧化刺激而引发得一系列的脑缺血再灌注损伤，NOX是过氧化损伤ROS的主要来源，抑制NOX，尤其是NOX2亚型明显减少了脑缺血损伤，灯盏花乙素结构具有对抗自由基的作用，因此，NOX2-ROS是灯盏花乙素靶向缺血再灌注损伤神经治疗的关键机制。其中，缝隙连接蛋白Cx（connexins），连接参与诸多病理过程包括过氧化激酶，目前有研究证实NOX与Cx43存在相关性。【28】UphamBL研究证实抑制NOX和ROS调控了Cx43的表达和功能[28]。在心力衰竭的兔子模型也证实NOX参与了Cx43的下调[29]。而在神经损伤领域，NOX与Cx43的关联性及其上下游调控的关系尚未见报道。而NOX2又是导致脑缺血再灌注过氧化损伤的主要来源。那么，我们是否可以假想：灯盏花乙素治疗心脑血管栓塞再灌注损伤的机制是通过抑制NOX2的表达，而减少自由基，上调Cx43，从而调控缺血再灌注损伤神经元存活。NOX2-ROS-Cx43通路参与灯盏花乙素对缺血再灌注损伤神经元的保护作用。存在的问题及思考：上述研究表明，灯盏花乙素作为我国的传统药物，在心脑血管缺血性疾病中有很好的疗效，并起到了改善和保护损伤后神经元的作用，但其主要的发病机制目前仍不明确。鉴于此，我们认为：灯盏花乙素很可能会靶向调控NOX2的表达，同时，是否存在这样一条通路：“NOX-ROS-Cx43”参与灯盏花乙素治疗脑缺血再灌注后神经元损伤的作用机制，即：灯盏花乙素-清除自由基-NOX2下调-ROS减少-Cx43增加-神经损伤保护。该假说是否成立，及其损伤及保护机制，有待进一步研究。参考文献：[1]RogerVL,GoAS,Lloyd-JonesDMetal.Heartdiseaseandstrokestatistics–2011update:areportfromtheAmericanHeartAssociation.Circulation,2011,123,18–209.[2]WorldHealthOrganization(WHO).Theatlasofheartdiseaseandstroke.WorldHealthOrganization,Geneva,2004.[3]张葆搏。脑血管疾病流行病学。郭玉璞主编，神经病学。北京:人民卫生出版社，2006,721.[4]MolinaCA.Reperfusiontherapiesforacuteischemicstroke:currentpharmacologicalandmechanicalapproaches.Stroke,2011,42,16–19.[5]卜燕。灯盏花素治疗脑梗死疗效观察。中国民康医学，2012,24(8)。[6]张卫东，陈万生，王永红，等。灯盏花黄酮苷化学成分的研究。中草药，2000，31（8）：565－566.[7]QianL,ShenM,TangHetal.Synthesisandprotectiveeffectofscutellareinonfocalcerebralischemia/reperfusioninrats.Molecules.2012,6,17(9),10667-74.[8]GuoLL,GuanZZ,HuangYetal.Theneurotoxicityofβ-amyloidpeptidetowardratbrainisassociatedwithenhancedoxidativestress,inflammationandapoptosis,allofwhichcanbeattenuatedbyscutellarin.ExpToxicolPathol,2012,25.[9]GuoH,HuLM,WangSXetal.Neuroprotectiveeffectsofscutellarinagainsthypoxic-ischemic-inducedcerebralinjuryviaaugmentationofantioxidantdefensecapacity.ChinJPhysiol.2011,31,54(6),399-405.[10]ZhangHF,HuXM,WangLXetal.Protectiveeffectsofscutellarinagainstcerebralischemiainrats:evidenceforinhibitionoftheapoptosis-inducingfactorpathway.PlantaMed,2009,75(2),121-126.[11]刘宏，杨祥良，周林珠，徐辉碧。灯盏花乙素清除活性氧作用的研究，中药材，2002-07-15。[12]卢晓梅，赵红，张海鹏。灯盏花素对脑缺血再灌注小鼠明胶酶及血脑屏障通透性的影响。中国医科大学学报,2006,355-481。[13]KurodaS,SiesjoBK.Reperfusiondamagefollowingfocalschemia:pathophysiologyan