牛奶中嗜冷菌危害及其检测方法

牛奶中嗜冷菌危害及其检测方法摘要:虽然低温保藏及冷链技术限制了牛奶中微生物的繁殖与代谢,但是在低温环境中恰恰非常适合嗜冷菌的生长代谢,并影响牛奶质量。生产中通常用巴氏杀菌和超高温灭菌来杀灭牛奶中的嗜冷菌,却无法消除由嗜冷菌所分泌的较高的耐热性的脂肪酶和蛋白酶,进一步影响乳及乳制品风味质地。因此快速检测牛奶中的嗜冷菌,对于控制生牛奶中嗜冷菌繁殖、提高乳制品产品质量、延长货架期等都具有重要的现实意义。本文主要总结与讨论了牛奶中嗜冷菌的危害以及几种常见的对原料奶中嗜冷菌快速检测的方法,包括直接荧光过滤技术、电阻抗法、酶联免疫吸附法、流式细胞计数法、氨肽酶法、聚合酶链反应结合酶联免疫吸附法,并将它们在工业应用上的优缺点进行了比较。关键词:嗜冷菌;原料乳;快速检测;危害ABSTRACT:Thetechniquesofcryopreservationandcoldchainlimitthemicrobialreproductionandmetabolisminmilk.However,alowtemperatureenvironmentisverysuitableforthegrowthandmetabolismofpsychrophilicbacteria.Pasteurizedandultrahightemperaturesterilizationisusuallyusedtokillpsychrophile,buttheyareunabletoremovetheheat-resistantlipaseandproteaseproducedbythepsychrophile,finallytoaffecttheflavorandtextureofdairyproducts.Therefore,rapiddetectionofmilkpsychrophileinrawmilkisimportantformicrobialcontrol,qualityimprovementandshelf-lifeextending.Thispapersummarizesanddiscussesthehazardsofpsychrophileinmilk,aswellasseveralcommonrapiddetectionmethodsforpsychrophileinrawmilk.Thesemethodsincludedirectfluorescencefilteringtechnology,electricalimpedancemethod,enzyme-linkedimmunosorbentassay,flowcytometry,aminopeptidaseenzyme,.Theadvantagesanddisadvantagesinindustrialapplicationarealsocompared.KEYWORDS:psychrophilicbacteria;rawmilk;rapiddetection;hazard引言嗜冷菌是一类菌的总称,这类菌一般是在0℃～20℃之间最适宜生长,由于这个温度范围与其他菌的最适生长温度范围相比要低很多,故此得名嗜冷菌。嗜冷菌主要包括两类微生物。一类是专性嗜冷菌(Psychrophiles),另一类为兼性嗜冷菌(Psychrotrophics)又名耐冷菌[1]。其中专性嗜冷菌最高生长温度不超过20℃,最适生长温度为15℃或者更低,在0℃依然可以生长繁殖。而兼性嗜冷菌的最高生长温度高于20℃,最适生长温度高于15℃,0℃～5℃也能生长繁殖,适应的温度范围更广,在环境中存在更为广泛,食品中的腐败菌大部分为兼性嗜冷菌。嗜冷菌种类繁多,在已知的嗜冷菌中,细菌是数量和种类最多的一类,涉及30多个属,其中属于革兰氏阴性的假单胞菌属(Pseudomonas)和革兰氏阳性的杆菌属(Bacillus)较多。这些嗜冷菌广泛地分布于各种低温环境中。除细菌外,在寒冷地区也发现有放线菌、霉菌、酵母和低温藻类[2]。1牛奶中主要的嗜冷菌及嗜冷菌的危害1.1牛奶中的嗜冷菌牛奶中的嗜冷菌中最常见的是假单胞菌属(Pseudomonas),特别是荧光假单胞(Ps.fluorescens)。除此之外还存在有产碱杆菌属(Alcaligenes),色杆菌属(Chromobacterium),黄杆菌属(Flavobacterium),芽孢杆菌属(Bacillus),梭菌属(Clostridium),棒状杆菌属(Coryncbacterium),链球菌属(Streptococcus),乳杆菌属(Lactobacillus)和微球菌属(Microbacterium)等。在假单胞菌中,部分假单胞菌具有强力分解脂肪和蛋白质的能力,可将原料奶中蛋白分解成蛋白胨,把脂肪分解从而产生脂肪哈败味。产碱杆菌,其本身不能分解原料奶中的糖类产酸,但其能产生灰黄色、棕黄色的色素,使得原料奶中所含的有机盐分解成碳酸盐,从而使牛奶转变为碱性,并导致乳品产生黏性变质。1.2嗜冷菌的危害微生物中嗜冷菌的污染是影响乳产品保质期的最主要因素。作为冷藏原料奶中生长的优势菌群,嗜冷菌在原料奶没有及时冷却、冷却温度不达要求或贮存时间过长时,就会大量繁殖,并产生耐热水解酶,如蛋白质分解酶和脂肪分解酶,这些水解酶能破坏牛奶中的主要成分、脂肪、蛋白质和卵磷脂。嗜冷菌胞外蛋白酶耐热的机制在于经过高温处理后,未被破坏的处于非折叠状态的蛋白酶分子(无活性)重新折叠成有活性的天然构象。因此该类酶能够耐受巴氏杀菌(72℃/15s)和超高温(UHT)(120℃～150℃/0.5～8.0s)灭菌工艺处理,在低温贮存过程中逐渐被激活,并在奶制品储藏过程中继续分解其中的脂肪和蛋白质,导致产品出现苦味、结块、分层,从而引起牛奶腐败变质[3]。总之,嗜冷菌能破坏原料奶中成分,主要是由于嗜冷菌活动产生能分解脂肪、蛋白质的耐热脂肪酶、蛋白酶。这些热稳定性胞外降解性酶类(主要是脂肪酶、蛋白酶)在巴氏杀菌消毒过程中基本不受影响,甚至经过超高温杀菌处理后仍能保持部分活性,最终,蛋白酶水解乳蛋白带来例如苦味、异味、果味和酵母味等非正常风味;而脂肪酶水解牛奶脂肪的过程会释放出一些游离脂肪酸,这些脂肪酸会造成牛奶制品腐臭、异味、碱味和苦味[4]。由于游离脂肪酸增加,乳产品风味将会出现如乳酪味、腐烂味、不洁味或酵母味等不良风味。这些由嗜冷菌产生的脂肪酶、蛋白酶还会造成片式热交换器的淤塞,造成清洗困难[5]。2嗜冷菌的检测方法及其分析比较嗜冷菌危害的严重性,更加突显出嗜冷菌检测方法的重要性。2.1检测方法目前对于原料乳中嗜冷菌的检测方法有很多种,但这些方法在时间及针对性上都存在各自的缺陷。在上世纪90年代,对微生物快速、自动化检测的研究已经进入了蓬勃发展的阶段,那些基于微生物学、化学、生物化学、生物技术、免疫学技术、血清学技术的快速、自动化分析方法均可应用于食品中微生物的分离、前期检测、特性研究及计数。这其中大多数方法都适用于对奶制品的检测。目前公认的方法主要有三类:一、平板检测及其改良方法;二、直接检测法;三、间接检测法。其中直接检测方法包含直接荧光过滤技术、流式细胞计数法、实时聚合酶链反应检测法、聚合酶链反应结合酶联免疫吸附法、荧光原位杂交探针法、时间/温度梯度凝胶电泳、双向电泳、ATP生物发光法;间接检测方法包含测定游离脂肪酸、测定氨肽酶活性、鲎变形细胞溶解物、酶联免疫吸附法、电阻抗法、石英晶体微天平。而以上各类检测方法中平板检测法、直接荧光过滤技术、电阻抗法、酶联免疫吸附法、流式细胞法、氨肽酶法这六种属于比较常见的检测方法。2.1.1平板检测法平板检测法是取样品稀释液接种至琼脂培养基,在5℃～6.5℃恒温培养10天后计数。或者将样品在21℃增菌培养后,采用选择性培养基在21℃培养25h,然后将样品中G-杆菌作为嗜冷菌污染的指标。平板检测法是比较常见的一种方法,但存在着很多缺陷。经过改进,在美国3M公司的细菌总数测试纸片的支持下,纪振杰等,利用标准平板计数法的原理,在4℃下培养样品10d,使得平板检测操作更简单,观察更方便。虽然平板计数法耗时比较长,但是计数结果比较准确,所以常常作为衡量各种快速检测方法相关性的标准值。2.1.2直接荧光过滤技术(directepifluorescentfiltertechnique,DEFT)直接荧光过滤技术是将经胰蛋白酶和TritonX–100处理过的原料乳进行膜过滤,原料乳中的微生物就会被留在过滤器上面。然后对膜上的细菌进行吖啶橙着染,再置于紫外显微镜下进行观察[6-7]。被染成绿色荧光的是死亡细胞,而呈现橘红色、橘灰色或者橘黄色荧光的则为存活下来的细胞。最后用仪器来进行计数处理。作为一种快速检测方法,直接荧光过滤技术相对于传统的培养计数检测有了较好的改进。该检测方法与平板检测法的相关性系数为0.91～0.94[8]。DEFT方法的优点在于系统使用简单,运用图像分析仪在紫外显微镜下观察计数,每小时处理的样本可以大于100个,检测数量较大。而且整个检测过程时间上相对于平板检测具有很大的优越性,检测结果可以在1小时内获得。DEFT方法的缺点在于对嗜冷菌没有特异性识别,检测出来的是冷藏原料乳中细菌的总数量,缺少针对性。而且当检测样品中细菌含量较少时,还需要对检测样品进行预培养处理来增加目标微生物的数量,从而提高检测结果的精确度。虽然检测时间很短,但是预培养所需要的时间比较长,一般要24～48h或者更长,所以预培养会相对耗时一些。再者,该检测方法所需要的仪器比较昂贵,检测成本较高,在实际工业应用上较难开展。2.1.3电阻抗法(electricalimpedancemeasurement)电阻抗法是通过测量微生物代谢引起培养基的电特性变化来测定样品微生物含量的一种快速检测方法。在培养过程中,微生物生理代谢作用会激活培养基中的电惰性物质。随着微生物增长,培养基中电活性分子和离子逐渐取代了电惰性分子,使其电导性增强,电阻抗降低。研究表明,电导率随时间的变化曲线与微生物生长曲线十分相似,当微生物的起始数量不同时,出现指数增长期的时间也不同,通过建立二者之间的关系,就能通过检测出培养基电特性变化推演出微生物的原始数量[9]。起初电阻抗法被用于检测原料乳中的嗜冷菌数量和细菌总数时,得出的结果与平板计数法相关度很低。Firstenberg等,通过优化微生物的生长条件,控制培养温度,在测定原料奶中嗜冷菌数量和细菌总数时,得到了电阻抗测定结果和标准平板计数结果之间很高的相关系数,使电阻抗法在原料奶检测方面的应用步伐向前推进了一大步。目前该技术已经被开发成商用系统,如BACTOMETER和MALTHUS,可以快速有效地报告出细菌总数或特定菌群数。该检测方法与平板检测法的相关性系数为0.96。电阻抗法的优点在于它是利用仪器来对样品进行测定,检测时间比传统的标准平板计数法要缩短很多,从而大大减少人力的投入。由此看出,电阻抗方法相对于平板计数检测法在工业应用上具有优越性。电阻抗法的缺点在于虽然相对于平板检测法,电阻抗法所需时间缩短很多,但是要是用于现代工业中检测大量待测原料奶样品,10～21h的检测时间仍显较长。这样会使得电阻抗法在工业上的推广利用受到限制。2.1.4酶联免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)酶联免疫吸附法是一种通过让抗体与酶复合物结合,然后通过显色来检测的方法,简称ELISA法。这是基于酶反应的一种高灵敏度和高特异性的检测方法,可以从复杂的样品体系中与目标反应物特异结合,从而进行检测。该检测方法与平板检测法的相关性系数为0.96。酶联免疫吸附法的优点在于得到的结果与标准平板计数法相似,而且它的灵敏度还很高。酶联免疫吸附法的缺点在于,由于像牛奶中的酪蛋白和乳清蛋白会和目标微生物竞争与抗体结合,此时会对样品带来干扰作用,影响酶联免疫吸附法检测样品中的目标微生物。2.1.5流式细胞计数法(flowcytometrymethod,FCM)流式细胞计