牛流行热病毒抗体说明书定性

1牛流行热病毒抗体酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定牛血清，血浆及相关液体样本中流行热病毒抗体水平。实验原理：本试剂盒采用双抗原夹心酶联免疫法（ELISA）测定标本中牛流行热病毒抗体。用纯化的流行热病毒抗体抗原包被微孔板，制成固相抗原，可与样品中流行热病毒抗体相结合，经洗涤除去未结合的抗体和其他成分后再与HRP标记的流行热病毒抗体抗原结合，形成抗原-抗体-酶标抗原复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），与CUTOFF值相比较，从而判定标本中牛流行热病毒抗体的存在与否。试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×481×962-8℃保存阴性对照0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存阳性对照0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存样本处理及要求：1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/2分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。5.组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。6.标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.7.不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。操作步骤：1.编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照2孔、阳性对照2孔、空白对照1孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）2.加样：分别在阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照（标准品）100μl。然后在待测样品孔先加样品稀释液50μl，然后再加待测样品50μl。轻轻晃动混匀，3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。4.配液：将30（48T的20倍）浓缩洗涤液加蒸馏水至600ml后备用5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl(或一滴)，空白孔除外。7.温育：操作同3。8.洗涤：操作同5。9.显色：每孔先加入显色剂A50μl(或一滴)，再加入显色剂B50μl(或一滴)，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟10.终止：每孔加终止液50μl(或一滴)，终止反应（此时蓝色立转黄色）。11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。结果判定：结果判定：试验有效性：阳性对照孔平均值≥1.00;阴性对照平均值≤0.15临界值（CUTOFF）计算：临界值=阴性对照孔平均值+0.20阴性判定：样品OD值临界值（CUTOFF）者为牛流行热病毒抗体阴性阳性判定：样品OD值≥临界值（CUTOFF）者为牛流行热病毒抗体阳性注意事项1．操作严格按照说明书进行，本试剂不同批号组分不得混用。2．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。3．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。4．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。5．底物请避光保存。6．试验结果判定必须以酶标仪读数为准，使用双波长检测时，参考波长为630nm7．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。终止液为2M的硫酸，使用时必须3注意安全。保存条件及有效期1．试剂盒保存：；2-8℃。2．有效期：6个月4FORRESEARCHUSEONLYBovineEphemeralfevervirusantibodyDrugNamesGenericName：BovineEphemeralfevervirusantibody(EFVAb)ELISAKit.PurposeThiskitallowsforthedeterminationofEFVAbinBovineserum,andotherbiologicalfluids.PrincipleoftheassayThekitassayEFVAblevelinthesample，usePurifiedEFVAbantigentocoatmicrotiterplatewells,makesolid-phaseantigen,thenaddEFVAbtowells,CombinedWithEFVAb,afterwashingandremovingnon-combinativeantibodyandothercomponents,thenCombinedEFVAbantibodywhichWithHRPlabeled,afterwashingCompletely,AddTMBsubstratesolution,TMBsubstratebecomesbluecolorAtHRPenzyme-catalyzed,reactionisterminatedbytheadditionofasulphuricacidsolutionandthecolorchangeismeasuredspectrophotometricallyatawavelengthof450nm.ComparedwiththeCUTOFFvalue,accordingtothistojudgeEFVAbexistinthesampleornot.5MaterialsprovidedwiththekitMaterialsprovidedwiththekit48determinations96determinationsStorageUsermanual11Closureplatemembrane22Sealedbags11Microelisastripplate112-8℃Negativecontrol0.5ml×1bottle0.5ml×1bottle2-8℃Positivecontrol0.5ml×1bottle0.5ml×1bottle2-8℃HRP-Conjugatereagent3ml×1bottle6ml×1bottle2-8℃Samplediluent3ml×1bottle6ml×1bottle2-8℃ChromogenSolutionA3ml×1bottle6ml×1bottle2-8℃ChromogenSolutionB3ml×1bottle6ml×1bottle2-8℃StopSolution3ml×1bottle6ml×1bottle2-8℃washsolution（20ml×20fold）×1bottle（20ml×30fold）×1bottle2-8℃Specimenrequirements1.serum-coagulationatroomtemperature10-20mins，centrifugation20-minatthespeedof2000-3000r.p.m.removesupernatant,Ifprecipitationappeared,Centrifugalagain.2.plasma-usesuitedEDTAorcitrateplasmaasananticoagulant,mix10-20mins,centrifugation20-minatthespeedof2000-3000r.p.m.removesupernatant,Ifprecipitationappeared,Centrifugalagain.3.Urine-collectsueasterilecontainer,centrifugation20-minatthespeedof2000-3000r.p.m.removesupernatant,Ifprecipitationappeared,Centrifugalagain.TheOperationofHydrothoraxandcerebrospinalfluidReferencetoit.4.cellculturesupernatant-detectsecretorycomponents,collectsueasterilecontainer,centrifugation20-minatthespeedof2000-3000r.p.m.removesupernatant,detectthecompositionofcells,DilutcellsuspensionwithPBS（PH7.2-7.4）,Cellconcentrationreached1million/ml,repeatedfreeze-thawcycles,damagecellsandreleaseofintracellularcomponents,centrifugation20-minatthespeedof2000-3000r.p.m.removesupernatant,Ifprecipitationappeared,Centrifugalagain.65.Tissuesamples-Aftercuttingsamples,checktheweight,addPBS（PH7.2-7.4）,Rapidlyfrozenwithliquidnitrogen,maintainsamplesat2-8℃aftermelting,addPBS（PH7.4）,HomogenizedbyhandorGrinders,centrifugation20-minatthespeedof2000-3000r.p.m.removesupernatant.6.extractassoonaspossibleafterSpecimencollection,andaccordingtotherelevantliterature,andshouldbeexperimentassoonaspossibleaftertheextraction.Ifitcan’t,specimencanbekeptin-20℃topreserve,Avoidrepeatedfreeze-thawcycles.7.Can’tdetectthesamplewhichcontainNaN3,becauseNaN3inhibitsHRPactive.Assayprocedure1.Number:tosamplecorrespondmicrotitrationwellandNumberSequence,ea