环境毒理学实验

环境毒理学实验姓名:吴天真班级：生物1501学号：201547005联系方式：18342209941队友：高秋远梁旭实验一污染物对藻类的生长抑制作用一、实验目的1.了解藻类的生长规律；2.掌握藻类的培养方法；3.掌握化学物质对单细胞绿藻生长影响的评价方法。二、实验内容1.运用毒理学实验方法，观察藻类在含有化学污染物的水环境中的生长抑制情况；2.求出受试化合物对藻类生长抑制的EC50；3.阐明受试化合物的剂量－效应关系与生长抑制特征。三、实验原理单细胞藻类个体小、世代时间短，是水体中的初级生产者。因为可在短期内获得化学物质对其许多世代及种群水平上的影响，所以利用污染物对藻类生长的抑制作用，能反映污染物水平对水体中的初级生产者的作用情况。通过将不同浓度的受试物加到属于对数生长期的藻类中，在规定的实验条件下继续培养，每隔24h测定藻类种群的浓度或生物量，以观察受试物对藻类生长的抑制作用。经方差分析或t检验，显著低于对照(p0.05)的生长率表明藻类生长受到抑制。四、实验仪器和试剂1.受试物研究藻类生长抑制实验的受试物应当是挥发性低、环境稳定性好且可溶于水的物质。如果需要助溶剂，它在水中的浓度不能超过0.1mL/L。2.藻种斜生栅藻(Scenedesmusobliquus)或蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)。3.培养基藻类的培养基很多，其成分和浓度各不相同，小球藻和栅藻可用“水生4号”培养基培养。配制培养基时可将营养盐类按所需浓度直接加入无菌蒸馏水或去离子水中。应按顺序逐个加入，待一种盐类完全溶解后再加另一种。亦可先配制各种营养盐类的浓度储液，经灭菌后避光冷藏保存。当需要配制营养基时，将一定量的浓储备液摇匀，依次加入到蒸馏水或去离子水中即可。*取少量菜园土，加2-3倍自来水，煮沸10余分钟，冷却后用滤纸过滤即可使用。4.实验器材电子天平(2台)、立式压力蒸汽灭菌器(2台)、无菌操作台(4台)、显微镜(4台)、生化培养箱(2台)、pH计(4套)、气浴恒温摇床(4台)、可见分光光度计(4台)、数字照度计(2台)、血球计(4套)、血小球记数板(200块)、4到7只30W的普通白色荧光灯、ф60漏斗(4个)、锥形瓶、温度计、滤纸和纱布等若干。5.实验药品硫酸铵、磷酸二氢钙、碳酸氢钠、氯化钾、硫酸镁、氯化铁均为分析纯，土壤浸出液。五、实验步骤1.藻类培养培养温度为：24±2℃；白色荧光灯均匀光照，光照强度为4000±400lux，连续光照或以12：12或14：10光暗比光照；机械震荡(100±10次/min)；培养容器用棉塞、滤纸、纱布(2-3层)或锡箔纸等封闭，对挥发性化学物质采用磨口玻璃瓶塞完全封闭。可根据实验需要选择容量不同的实验容器，125mL锥形瓶中测试液的体积为40-60mL；250mL锥形瓶中测试液体积为70-100mL；500mL锥形瓶中测试液的体积为100-150mL。2.藻试液的配制从储备液中取出一定的藻液，接种到新鲜的无菌培养液中，接种浓度约为105个/mL。在与试验要求相同的条件下进行预培养，要求在2-3天内藻类能达到对数生长，然后再次转移到新鲜的培养液中。如此反复转接培养2-3次，藻类生长健壮并开始处于对数生长期时即可用来制备实验中需要的藻类试验液。3.受试物试验液的配制根据初步试验确定产生效应的浓度范围，至少设置五个构成对数间距系列的浓度，浓度比不超过2.2。较佳的浓度范围为，最低测定的浓度必须对藻类生长影响较小(如生长抑制率10%)，最高测定浓度对藻类生长的抑制率接近100%。至少设置3个平行样，每一系列设一个对照。实验前应测定受试液的pH，必要时用盐酸或氢氧化钠溶液将pH调到7.5±0.2。试验结束时应测定被测物质的实际浓度。4.测试液的配制先在每个试验锥形瓶中加入10mL藻液，再加10mL受试物溶液。对照组只加10mL培养液。将各瓶摇动混匀后，放入光照培养箱中培养。实验开始后，每隔24h(即在24，48h)测定各组藻类的细胞密度。六、实验结果1.藻类生长的测定藻类生长是指在试验期间每毫升溶液中藻类细胞数目的增加量。一般用以下三种方法测定藻类的生长：①细胞计数；②测光密度；③测叶绿素含量。推荐使用方法①和②。2.数据处理将不同浓度试验培养液和对照培养液的藻细胞浓度与测试时间绘制成曲线图，再用下面方法确定浓度效应关系。生长率是单位时间内(tn-t1)藻类细胞增长的量(Nn-Nt)。对数生长期的藻类平均特定生长率可用下式计算：（1）式中：μ——藻类平均生长率；t——培养时间，t1为起始时间，tn为终了时间；N——藻类细胞生长量，N1为起始细胞数，Nn为最终细胞数。以不同浓度组中藻类生长率的下降比例与对数浓度作图，可直接从图上读出EC50，再标明测定时间，如24hEC50。也可求出回归关系式，再算出EC50。表2实验记录表格根据直线内插法或概率单位图解法估算24h、48h和72h藻类生长受到抑制的EC50。测得的实验数据如下：生物量单位：10^5个/mL时间浓度0205080110020508011002050801104313.62745.31272.6627.63440.88289439897.91840.3584.63177.88187988985.31003.5131.6337.753094.52858.5904.38691.38602.134096812712710458.25160.1313844183461265.665.753537842564.9994.88845.547720402107861881.9717.585.25162557330.9663.38203.6311.625平均值3730.72722.91057.287721.5033506.6730104.3311131.971477.4586.7933141.08671629911554.07977.4933133.6728.125生物量2.223221.618540.6191720.4177020.28880218.04746.663980.871240.3368760.0694529.76426.917240.5712960.0650020.00167548h时72h时24h时荧光强度时间受试物浓度0205080110生物量2.223221.618540.6191720.4177020.288802生长率0.0545740.0413480.001311-0.01509-0.03047生物量18.04746.663980.871240.3368760.069452生长率0.0872520.0589660.014231-0.00896-0.05938生物量9.76426.917240.5712960.0650020.001675生长率-0.025590.001554-0.01758-0.06855-0.1552487224根据直线内插法或概率单位图解法估算24h、48h和72h藻类生长受到抑制的EC50:24hEC50=3.3548hEC50=3.3972hEC50=3.47七、注意事项1.在正式试验前必须进行必要的预试验。2.实验藻种的选择和预培养应注意：藻细胞大小均匀，颜色鲜绿，处于对数生长期。试验开始3天内，对照组藻细胞浓度至少应增加16倍。3.需要明确受试化合物的理化特性，有针对性的进行实验。八、讨论与思考1.干扰藻类EC50正常测定的因素有哪些？（1）各锥形瓶在培养箱内的位置不同，受光程度不同，导致藻类生长情况受影响。（2）在藻类培养过程中，部分藻类沉淀，影响受光（3）测定吸光度时，藻液未混合均匀，导致测得的数据与实际不符、2.受试物质对藻类的生长在不同时期起的作用有何不同？有无促进作用？随着时间增加，高浓度抑制作用加强，低浓度促进作用加强。3.根据实验结果，提示进一步开展哪方面的研究？可进行以下几个方面的研究：（1）探究受试物影响藻类生长的具体原因；（2）探究该受试物是否对其他植物有类似的左右；（3）实验成果的具体应用。实验二污染物对发光细菌的急性毒性测试发光菌毒性测试是20世纪70年代后兴起的一种微生物监测环境污染及检测污染物毒性的新方法。1978年美国Beckman公司即推出功能完备的生物发光光度计“Microtox”，自此，这一急性毒性测试技术在世界范围内迅速推广。因此人们也将发光菌毒性测试称为Microtox测试。采用现代光电检测手段(生物发光光度计)的发光菌生物毒性实验是毒理学中生物测定的方法之一。该方法快速、简便、灵敏、廉价,在有毒物质的筛选，环境污染生物学评价等方面有重要的意义，因而备受各国有关研究者的关注。1995年3月，国家环境保护局、国家技术监督局将发光菌毒性测试定为水质监测标准方法(GB/T15441-1995)。一、实验目的1.掌握发光细菌毒性测试的标准方法；2.根据发光细菌发光强度的变化判断受试化合物的毒性；3.初步了解发光细菌毒性测试的影响因素。二、实验内容1.发光细菌的复苏；2.发光细菌发光强度的测定；3.受试化合物毒性的计算。三、实验原理发光细菌是一种非致病性的普通细菌，具有发光能力，在正常条件下经培养后能发出肉眼可见的兰绿色光，这种发光过程是细菌体内一种新陈代谢反应，是氧化呼吸链上的一个侧支。发光细菌的发光反应模式图(1)所示。发光细菌发光反应途径可简单概述为：FMNH2＋O2＋RCHO→荧光＋FMN＋H2O+RCOOH(1)这个发光现象是呼吸代谢耦合，作为光能被散发。当细菌体内合成萤光酶、萤光素、长链脂肪醛时，在氧的参与下发生生化反应，反应的结果便产生光。发光菌的发光现象是其正常的代谢活动,在一定条件下发光强度是恒定的，与外来受试物(无机、有机毒物,抑菌、杀菌物等)接触后,其发光强度即有所改变。变化的大小与受试物的浓度呈相关关系,同时与该物质的毒性大小有关。通常认为外来受试物通过下面两个途径抑制细菌发光:(1)直接抑制参与发光反应的酶类活性;(2)抑制细胞内与发光反应有关的代谢过程(如细胞呼吸等)。毒物的毒性可以用EC50表示,即发光菌发光强度降低50%时毒物的浓度。实验结果显示,毒物浓度与菌体发光强度呈线性负相关关系。因而可以根据发光菌发光强度判断毒物毒性大小,用发光强度表征毒物所在环境的急性毒性。图(1)发光细菌的发光反应模式。E1:细菌荧光素酶，由α、β2个亚基组成，α为40000-42000D，β为37000-39000D。单独α、β亚基均无发光活性，只有α、β共存时才有活性。E2:NADH：FMN氧化还原酶，分子量为3000D，对FMN有高度特异性。E3:脂肪酸还原酶。四、实验仪器与材料1.试剂：氯化汞（分析纯）；氯化钠（化学纯）；蒸馏水。氯化钠溶液，2.0g/100ml(3.0g/100ml)，称取2.0g(3.0g)氯化钠溶于100ml蒸馏水中，置于2-5℃冰箱备用。氯化汞母液，2000mg/L，万分之一分析天平精称密封保存良好的无结晶水氯化汞0.1000g于50ml容量瓶中，用3.0g/100ml氯化钠溶液稀释至刻度，置于2-5℃冰箱备用，保存期6个月。氯化汞工作液，2.0mg/L，用移液管吸取氯化汞母液10ml入1000ml容量瓶，用3.0g/100ml氯化钠溶液定容。再用移液管吸取氯化汞20mg/L液25ml入250ml容量瓶，用3.0g/100ml氯化钠溶液定容，将此液倒入配有半微量滴定管的试液瓶，然后，用3.0g/100ml氯化钠溶液将氯化汞2.0mg/L溶液按表1稀释成系列浓度(稀释至50ml容量瓶中)。配制的稀释液保存期不超过24小时。2.明亮发光杆菌T3小种(PhotobacteriumphosphoreumT3spp.)冻干粉，安培瓶包装，在2-5℃冰箱内有效保存期为6个月。新制备的发光细菌休眠细胞(冻干粉)密度不低于每克800万个细胞；冻干粉复苏2min后即发光，可在暗室内检验，肉眼可见微光，稀释成工作液后，经稀释平板法测定，每毫升菌液不低于1.6万个细胞(5毫升测试管)或2万个细胞(2毫升测试管)。在DXY-2型