环氧化物水解酶固定化研究现状

环氧化物水解酶固定化研究现状1.环氧化物水解酶/来源环氧化物水解酶(epoxidehydrolase,EH,EC.3.3.2.3)是一种醚水解酶，属于α/β水解酶家族。该酶可用于催化外消旋环氧化物的对映选择性水解，获得高附加值的手性合成中间体—光学纯的环氧化物或者邻位二醇。细菌:放射形土壤杆菌Agrobacteriumradiobacter,红球菌Rhodococcussp.,棒状杆菌Corynebacteriuimsp.,分枝杆菌Mycobacteriumparanicasm,卡诺氏菌Nocardiasp.，假单胞菌PseudomonasNRRLB-2994；（Steinreiber,A.etal.,2001；DeVriesetal.,2003；Archelas,A.etal.,2001；Orru,R.V.etal.,2001；Faber,K.etal.,1999）真菌：黑曲霉Aspergillusniger,小麦长蠕孢菌Helminthosporumsativum,白僵菌Beauveriasulfurescens；（Weijers,C.A.etal.,1999；Kim,H.S.etal.,2006；Yeates,C.A.etal.,2006）酵母菌：粘红酵母Rhodotorullaglutinis;（Kotik,M.etal.,2005）2.固定化EH（酶/细胞）现状2.1吸附法Kroutil等在研究来源于卡诺氏菌环氧化物水解酶固定化过程中，通过对比不同载体固定化酶活力回收发现，环氧化物水解酶吸附于DEAE-cellulose（二乙氨基乙基纤维素）上活力提高2倍以上。在固定化过程中混入非离子去垢剂（TritonX-100）可显著提高其热稳定性。(Kroutiletal.,1998)文献阅读过程中发现，利用吸附法固定化环氧化物水解酶研究中大部分都采用了DEAE-cellulose为载体，故列表对比固定化后各参数值。载体酶/菌酶活保留热稳定性重复批次底物EFromDEAE-cellulose酶90%—42-(对-硝基苯基)环氧乙烷减小Karbouneetal.,2010225%提高5（55%）1,2-环氧丁烷微降Kroutiletal.,199870%下降7（81%）2-(对-硝基苯基)环氧乙烷减小Karbouneetal.,200570%微降10（72.4%）缩水甘油苯基醚—贾涛等，200865%不变———Karbouneetal.,20012.2共价法—EupergitC/EupergitC250LYildirim等将环氧化物水解酶共价交联于环氧树脂EupergitC250L上（图1），使得其对环氧苯乙烯对映体选择性提高2.5倍左右、对环氧丙醇、环氧氯丙烷E均有提高，热稳定性、储藏稳定性亦显著提高（图2），操作稳定性表现为10个批次（活力保留95%、(S)-氧化苯乙烯ee99%）。(Yildirimetal.,2011；Yildirimetal.,2013)Mateo等通过将环氧树脂EupergitC进行改性（图），固定化过程即利用乙二胺或亚氨基二乙酸亲和攻击环氧树脂，接着中性PH下酶与载体共价结合，然后碱性条件下酶分子亲和官能团（氨基、巯基、羟基）与载体上其他环氧基团共价结合，最后添加小分子量的亲和试剂灭活未反应的环氧基团。(Mateoetal.,2003)通过EDA（乙二胺）改性环氧树脂方法固定化环氧化物水解酶酶活保留均达到95%以上，热稳定性较游离酶有大幅提高，重复利用12批次(S)-氧化苯乙烯ee99%，酶活未见明显损失。2.2吸附共价法—改性环氧硅胶Petri等将硅胶改性表面附带环氧基团后与来源于黑曲霉的环氧化物水解酶进行吸附共价连接，酶活保留达90%，最适T和PH均未变化，拆分2-(对-硝基苯基)环氧乙烷批次可达9次而酶活无显著降低。研究该固定化酶对助溶剂二甲基亚砜（DMSO）稳定性发现，相比于游离酶，固定化酶在含有20%助溶剂（DMSO）缓冲液中两周后酶活保留达70%以上（图）。(Petrietal.,2005)2.3交联法—磁性纳米SiO2颗粒Kim等利用具有船瓶结构的介孔SiO2装配磁性纳米颗粒后将来源于鱼类的环氧化物水解酶共价交联与此纳米酶反应器，该法载体的船瓶结构可有效避免固定化酶的渗漏，磁性颗粒使得固定化酶易重复，热稳定性较游离酶提高10倍以上，拆分氧化苯乙烯重复7个批次（活力保留50%）(S)-氧化苯乙烯ee98%。(Kimetal.,2013b)Kim等首先利用纳米磁性SiO2及聚苯胺纳米纤维对环氧化物水解酶进行共沉淀，再加入戊二醛进行交联，固定化酶拆分氧化苯乙烯，批次试验可达7次（活力残余40-50%）且ee均大于98%。(Kimetal.,2013a)2.4一锅固定化法—Ni-NTA-Fe3O4、NiO/Co(Ⅱ)-SiO2Wang等将氧化铁纳米颗粒与油酸共沉淀后与甲基丙烯酸缩水甘油酯共聚形成表面附着环氧基团的核壳结构，然后在依次与乙二胺、戊二醛、NTA（氮川三乙酸）衍生物形成席夫碱，最后Ni粒子螯合到NTA臂内，进而可以从粗酶液中一步选择性提取固定化带有His-tag重组酶。(Wangetal.,2011)2.4一锅固定化法—Ni-NTA-Fe3O4、NiO/Co(Ⅱ)-SiO2Wang等利用该法固定化环氧化物水解酶拆分2-(对-硝基苯基)环氧乙烷得到ee99%(R)-2-(对-硝基苯基)环氧乙烷，批次重复8次以上，酶活保留80%以上。(Wangetal.,2011)Choi等利用类似的方法（磁性SiO2装配NiO）一步固定化鱼类环氧化物水解酶拆分氧化苯乙烯得到ee98%(S)-氧化苯乙烯，批次可重复10次以上（酶活保留90%）。(Choietal.,2010)Cassimjee等将Wang等方法中用Co(Ⅱ)替代Ni-NTA亦成功实现对环氧化物水解酶的一锅法固定化。(Cassimjeeetal.,2011)2.5包埋法Maritz等将来源于红冬孢酵母的环氧化物水解酶细胞包埋于海藻酸钙内，活力保留50%，拆分1,2-环氧辛烷可重复操作8个批次（剩余酶活80%）。(Rhodosporidiumetal.,2003)邹等将来源于黑曲霉的环氧化物水解酶重组于大肠杆菌内菌体包埋于海藻酸钙内，酶活保留最高可达82.4%，拆分外消旋的环氧氯丙烷7个批次后酶活残余43%。(邹树平等，2013)2.6分子印迹法在有机溶剂（印记溶剂）中，模板分子在交联剂作用下与可聚合功能性单体（如甲基丙烯酸，4-乙烯基吡啶）聚合，当模板分子被取出后，聚合物中就形成了与模板分子空间构型相匹配的具有多重作用点的空穴，这样的空穴将对模板分子及其类似物（大小、形状、化学功能等）具有选择识别特性。(GaryJ.Lye,1999)Kronenburg等将来源于酵母菌的环氧化物水解酶首先在衣康酸酐作用下进行衍生化，接着在无水环己烷与乙二醇二甲基丙烯酸酯进行共聚合形成生物塑料，在共聚之前，蛋白酶分子在水相中经模板分子（底物）进行分子印迹。该报道是首次将分子印迹技术应用于隶属于α/β水解酶家族的环氧化物水解酶。(Kronenburgetal.,2001)研究发现，经不同构型底物（S型、R型）印记后酶对1,2-环氧辛烷的对映体选择性（E）发生明显变化，甚至颠倒。对不同构型1,2-环氧辛烷相对活力变化显著。将环氧化物水解酶与共聚体吸附固定化后发现，相较于游离酶半衰期最高提高15倍，且经强酸（HCl）洗脱后仍可保留50%酶活，游离酶在此情况下瞬间失活。3.小结及展望现阶段固定化环氧化物水解酶距离工业化固定化酶（如卡拉胶包埋腈水解酶重复批次达200批）尚有很大差距；对比发现EH固定化研究集中在环氧树脂Eupergit、DEAE-cellulose及磁性纳米SiO2颗粒三种载体；现阶段文献研究多为环氧化物水解酶固定化酶，固定化细胞报道不多；未见有固定化酶后进行填充床生物反应器连续操作拆分制备手性环氧化物的报道；寻找筛选成功工业化应用固定化酶/细胞方法值得借鉴。参考文献：Cassimjee,K.E.,Kourist,R.,Lindberg,D.,WittrupLarsen,M.,Thanh,N.H.,Widersten,M.,Bornscheuer,U.T.,Berglund,P.,2011.One-stepenzymeextractionandimmobilizationforbiocatalysisapplications.BiotechnolJ6,463-469.Choi,S.H.,Kim,H.S.,Lee,I.S.,Lee,E.Y.,2010.Functionalexpressionandmagneticnanoparticle-basedImmobilizationofaprotein-engineeredmarinefishepoxidehydrolaseofMugilcephalusforenantioselectivehydrolysisofracemicstyreneoxide.BiotechnolLett32,1685-1691.Devi,A.V.,Lahari,C.,Swarnalatha,L.,Fadnavis,N.W.,2008.Gelozymesinorganicsynthesis.PartIV:ResolutionofglycidateesterswithcrudeMungbean(Phaseolusradiatus)epoxidehydrolaseimmobilizedingelatinmatrix.Tetrahedron:Asymmetry19,1139-1144.Grulich,M.,Maršálek,J.,Kyslík,P.,Štěpánek,V.,Kotik,M.,2011.Production,enrichmentandimmobilizationofametagenome-derivedepoxidehydrolase.ProcessBiochem46,526-532.Karboune,S.,Amourache,L.,Nellaiah,H.,Morisseau,C.,Baratti,J.,2001.ImmobilizationoftheepoxidehydrolasefromAspergillusniger.BiotechnolLett23,1633-1639.Karboune,S.,Archelas,A.,Baratti,J.C.,2010.FreeandimmobilizedAspergillusnigerepoxidehydrolase-catalyzedhydrolytickineticresolutionofracemicp-chlorostyreneoxideinaneatorganicsolventmedium.ProcessBiochem45,210-216.Karboune,S.,Archelas,A.,Furstoss,R.,Baratti,J.,2005.ImmobilizationofepoxidehydrolasefromAspergillusnigerontoDEAE-cellulose:enzymaticpropertiesandapplicationfortheenantioselectiveresolutionofaracemicepoxide.JournalofMolecularCatalysisB:Enzymatic32,175-183.Mateo,C.,Archelas,A.,Fernandez-Lafuente,R.,Guisan,J.M.,Furstoss,R.,2003.Enzymatictransformations.ImmobilizedA-nigerepoxidehydrolaseasanovelbiocatalytictoolforrepeated-batchhydrolytickineticresolutionofepoxi