碳酸钙生物矿化的体外研究进展

0612xx-8437-冯庆玲碳酸钙生物矿化的体外研究进展冯庆玲，侯文涛（清华大学材料科学与工程系，北京100084）摘要：研究生物矿化的机理，可以为仿生制备新材料提供理论依据和合成手段，而碳酸钙是生物矿化的主要无机体系之一。本文首先综述了近年来碳酸钙体外研究中的一些重要结果，这些研究主要是使用不同的添加剂和模板调控碳酸钙的晶型与形貌，对于有机－无机界面诱导矿化的机理进行了进一步的验证和更为深入的探讨。然后介绍了一些最新的研究热点，这些研究采用了较为新颖的研究方法和思路，为碳酸钙生物矿化的研究提供了一些新的方向。关键词：仿生材料；碳酸钙；生物矿化中图分类号:Q811生物矿化过程广泛存在于自然界中，是生命参与并通过细胞、有机分子调制无机矿物沉积的高度控制过程。与合成材料相比，天然生物矿化材料具有特殊的高级结构和组装方式，揭示其控制机理，可以为材料科学相似的控制问题提供思路，为材料合成提供新的理论指导和设计依据。碳酸钙作为生物矿化的最主要的矿物之一，长期以来一直是材料学家、生物学家、矿物学家、医学家所关注的研究对象。碳酸钙具有多种晶型，比较稳定的有方解石和文石，在生物界中主要存在于软体动物的外壳、鸟类的蛋壳当中；另外，还有球文石（介稳相）、无定型碳酸钙（ACC）等晶型。研究者最为关注的问题就是生物体是怎样通过蛋白质达到调控方解石/文石晶型，怎样控制生长出复杂的微结构的。由于碳酸钙晶体在矿物学和化学领域中具有较深的研究基础，并表现出良好的取向性和晶粒外形，因此也广泛用于进行体外沉积，以探讨“有机－无机”界面的负电性、结构匹配等诱导作用。1使用不同添加剂和模板的体外沉积实验这类研究的目的主要在于分析有机的添加剂或模板对于碳酸钙晶型、生长形貌的影响作用，通过机理讨论以推测或者验证有机－无机的界面相互作用。沉积时可以通过滴定的方法，也可以通过扩散的方法提供碳酸根，使得溶液中的[Ca2+][CO32-]活度积达到过饱和，导致碳酸钙晶体的形核长大。按照添加剂和模板的不同，大致分为以下几个类别。0612xx-8437-冯庆玲1.1Mg2＋离子作为添加剂由于海水中含有0.13%质量的镁，很早之前人们就在对海洋生物矿化的研究中发现了镁离子对碳酸钙晶体沉积的影响。镁离子可以替换方解石中的钙离子位置，但却无法进入文石晶体的晶格。当溶液中镁离子含量较高时，这种作用可以抑止方解石晶核的形成而促使文石的晶核得以长大，达到调控晶型的目的[1]。因此在一些模拟生物体调控文石晶型的实验中，也会采用镁离子来诱导文石的生成[2]。镁离子还可以稳定无定型碳酸钙。Raz等人[3]研究了海胆幼体骨针中ACC过渡相，发现在没有镁离子时只有方解石相，而其中的蛋白质大分子不能诱导出ACC，这就说明镁离子在对无定型相的稳定中起着重要作用，而含镁量很高的方解石是通过含镁无定型相的晶型转变形成的。Meldrum等人[4]也发现了镁离子结合在ACC中很大程度延缓了其向晶体相的转变，这一影响随结合在ACC中的镁离子含量增加而增大。在生物体系中，镁与有机基质的共同作用对稳定ACC起到了重要的作用，含镁的ACC在长时间内是稳定的，可以在结晶化之前预造出理想的微结构和形状[5,6]。1.2酸性氨基酸或表面活性剂作为添加剂酸性氨基酸由于侧链带负电，可以吸引游离的或者是晶体表面的Ca2＋离子，从而改变碳酸钙的结晶过程[7]。Tong等人[8]使用左旋天冬氨酸调制出了多孔的球文石晶体，分析认为天冬氨酸与碳酸钙表面有着强烈的吸附作用，这种吸附作用抑制了方解石的形成，导致多孔结构的球文石晶相。Manoli等人[9]研究了谷氨酸对碳酸钙结晶的影响，认为其稳定了球文石晶型。表面活性剂在溶液中或界面处具有特殊的自组装形态，因此会影响沉积过程，使得无机晶体具有特殊的形貌。使用表面活性剂作为添加剂研究碳酸钙沉积的工作近年来刚刚展开，Li等人[10]制得了活性剂致稳的ACC纳米颗粒，这些几十纳米的颗粒在水溶液中可以转变为球文石的粒状或棒状颗粒（图1），而晶粒的外型可以通过调节Ca浓度、活性剂的浓度而达到。Donners等人[11]使用了另一种表面活性剂制得了ACC，并在几天后外部转变为方解石晶体。由于表面活性剂自组装形态的多样化，利用其控制碳酸钙的晶型和形貌也具有多样化的特点，这些工作有广泛的研究前景。0612xx-8437-冯庆玲图1活性剂导致的球文石纳米颗粒[10](a)粒状；(b)棒状1.3生物中提取的大分子作为模板或添加剂(体外模拟矿化)碳酸钙的体外模拟矿化研究主要基于软体动物壳系统。通过对壳层中有机质的提取，在体外环境中模拟贝类的体内微环境进行碳酸钙的沉积实验，以期了解是何种因素导致了方解石/文石的晶型选择。Levi等人[12]在2001年对传统的有机基质五层结构做了修正，发现类丝纤蛋白在晶体形成前是以胶体形态存在于层间的（图2）。这对未来的体外模拟实验设计提出了新的思路和要求。图2贝壳有机基质在晶体形成前的分布状态[12]0612xx-8437-冯庆玲Thompson等人[14]通过原子力显微镜观察到了在珍珠层蛋白存在时方解石的{104}面上会生长出(001)的文石晶体。Marxen[15]等人通过钙同位素在淡水蜗牛壳SM和IM表面的吸附发现，弱碱性条件下钙离子的吸附强于弱酸性条件，在使用类似外套膜溶液的环境下，钙离子在SM表面发生了更强烈的吸附作用。一些研究者主要采用生物化学的方法，用SDS-Page凝胶电泳分离珍珠层中的蛋白[13]，得到不同分子质量的可溶性蛋白，并且通过沉积实验发现某些组分可以特异性的诱导出文石晶体。Zhang等人[16]通过克隆分析珍珠牡蛎的一种特定分子量的SM，发现其具有类似表面活性剂的特征，中部为甘氨酸富集区，一端为亲水段，另一端为中性端，这样自组装以后就可以形成周期性的结构诱导无机晶体的生成。这些结果都证明了酸性大分子在决定碳酸钙晶体的晶型和取向上具有重要作用，而且其原因在于酸性大分子中具有很多的天冬氨酸和谷氨酸序列，其二级结构为反β折叠片，这样在酸性大分子的表面，就会分布着较多的酸性侧链-COO－，由于负电荷可以吸引钙离子。这种周期性的结构便会导致晶体的生成。1.4非生物提取大分子作为添加剂使用人工合成的大分子对于碳酸钙晶体进行调控的实验，基本上都是受上节提到的控制机理的启发。模仿生物体中的结构匹配原理，采用具有特殊的周期性结构的大分子，期望可以通过人为的方式从理论上预测并从实验上获得想要得到的晶型或者晶体取向，真正达到控制的目的。Gower等人[17]使用聚天冬氨酸沉积出了表面具有螺旋状坑洞的方解石，以及中空螺旋状形貌的球文石，在更高的聚天冬氨酸浓度下还可以在玻璃基底上形成膜层。分析认为这种形貌是由于晶核在溶液中沿着聚天冬氨酸表面形成并长大导致的。Falini[18，19]使用了含有聚天冬氨酸和聚谷氨酸的凝胶作为模板，通过改变凝胶中聚合物的含量，分别诱导出了具有一定取向的方解石、文石和球文石晶型，证明了微环境对决定晶体的晶型有着重要的作用。Kato等人[2，20]使用几丁质作为基底，类似酸性大分子的聚丙稀酸作为添加剂，也得到了文石薄膜。目前此类研究中并无非常理想的晶型控制结果。2近期研究热点前面介绍的研究属于比较传统的体外研究范畴。近几年来，出现了一些较为新颖的研究角度和方法，并获得了很好的实验结果。2.1微印法实现结晶位点控制在体外模拟实验中，研究者关注的主要是晶体晶型和形貌的变化，而使用微印法[21,22]控制固体表面的碳酸钙形成位点、大小、取向的研究则更偏重于工艺，为界面诱导控制提供0612xx-8437-冯庆玲了一个新的思路。Aizenberg等人[23,24]所使用的胶印是使用具有微米图案结构的橡胶印，用特制的“墨水”例如HS(CH2)nX(X=COOH，SO3H，OH)，在基底上进行微接触印制以后，含硫的一端会连接在基底上，露出X基团，而未接触的部分需要用HS(CH2)nCH3清洗而露出甲基基团，这样的表面倒置于碳酸钙过饱和溶液中时，由于X基团对于钙离子的吸附、形核诱导作用，刻印过的部分会生长出晶体而其他部分则没有。如图3，实验中如果选用不同的基底和墨水，可以得到取向不同的方解石晶体；使用不同的图案的橡胶印也可以得到不同的结晶图案；使用不同的钙离子浓度，则可以控制晶粒的数量和大小。图3使用花样橡胶模板印制后沉积的方解石晶体图案[24](a)单晶粒点阵；(b)多晶粒构成的花样D’Souza等人[25]使用的是另一种制印方法，首先在方解石或者文石的模板晶表面通过自组装形成膜层，然后使用交联剂将膜固定在聚合物上，通过酸溶除去模板晶体就得到了刻印面，刻印面置于碳酸钙过饱和溶液时就会在表面形核并长大为晶体。形成晶体的位置、大小等在很大程度上与模板晶类似。2.2使用AFM研究方解石在过饱和溶液中的生长原子力显微镜(AtomicForceMicroscopy，AFM)的优势在于可以扫描得到样品表面的细微起伏信息，其精确度可以达到原子高度。方解石表面的溶解和沉积微观信息就可以通过AFM的实时扫描被观察到。Teng等人[26,27]的研究发现，当台阶的产生和推移以一个螺位错为中心时，就会生长为一个螺旋生长小丘。当一个螺旋位错点开始螺旋生长时，其它的步阶因为超过了临界长度而开始向外生长，这些步阶的生长又导致原来没达到临界长度的步阶突破生长临界值。因此步阶的生长形成了一个循环促进的方式，使得在{104}面上的台阶沿着[481]+、[481]－和[441]+、[441]－四个易生长方向生长，形成一个类金字塔形的螺旋小丘（图4a）。当饱和生长溶液中有Mg2+或者有机添加剂时，晶体螺旋生长的形态就会有所改变[28]，如图4b。而分别使用左旋和右旋天冬氨酸时(图4c&d)，得到的形貌也具有镜面对称性，分析认为天冬氨酸在步阶负方0612xx-8437-冯庆玲向的特异性吸附改变了台阶边缘自由能，从而导致了步阶方向、推移速率的变化并最终造成了小丘外形的变化。另外，Tang等人[29]也使用类似的方法，对柠檬酸存在时的方解石表面螺旋生长进行了观察，发现柠檬酸改变了螺旋生长的临界长度，延迟了步阶的生长。图4方解石表面螺旋生长的AFM观察[27，28](a)螺旋生长小丘；(b)镁离子存在时的小丘；(c)左旋天冬氨酸存在时的小丘；(d)右旋天冬氨酸存在时的小丘这些研究通过对螺旋生长的动力学分析和计算，可以一定程度上将添加剂对碳酸钙晶体的界面作用进行量化表征。如果这种分析方法可以大量应用于有机－无机界面作用分析，积累足够的数据，必会大大促进矿化理论的完善，并为晶体控制提供可能的手段。2.3生物矿化的相转变机理生物矿化的传统观点认为控制的主要因素在于有机－无机的界面作用，贝壳壳层中的文石晶体是通过“异型形核”或者“矿物桥”得到的。前者认为，每个晶片都是由有机质诱导形核长大的，而后者认为层间基质中的孔洞使得晶片之间存在着物理上的连续生长。但是近期一些实验证据和研究焦点开始倾向于“相转变”理论。这些研究认为，壳层中的碳酸钙晶体并不是直接形成的，而是通过无定型碳酸钙作为前驱体，经过一段时间的相转变后才形成晶体。Hasse等人[30]与Weiss等人[31]通过对不同种类的幼生贝壳的研究发现，不论是棱柱层还是珍珠层当中都含有较多ACC相，而ACC在成年贝壳中含量很少，因此认为贝壳中的方解石或者文石相都是由ACC转变得到的。ACC在生物矿化过程中所起的作用，可能会比界面作用更为重要。Nassif等人[32]最近通过TEM高分辨相观察，发现贝壳珍珠层的文石板片边缘部分0612xx-8437-冯庆玲都存在着ACC相（图5），很可能是在发生ACC－文石相转变过程后残留下来的，这为上述观点提供了新的实验依据。图5珍珠层中文石板片边缘处的ACC相[32]结合1.1节中的一些研究结果，镁离子和有机基质在矿化过程中，可能稳定ACC相并减缓其向方解石或者文石相转变的过程，之后通过一定的规律决定晶相转变后的晶体取向。这与现有的异型形核、矿物桥理论是不同的思路。可以预见，相转变理论将会引起研究者们的更多关注，ACC在矿