测量酶方法

氮蓝四唑（NBT）法测定超氧物歧化酶（SOD）活力一、原理超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除O2，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。二、材料、仪器设备及试剂（一）材料；水稻或小麦叶片（二）仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯（反应试管处照度为4000Lx）；5.试管或指形管数支。（三）试剂:1.0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）；2.130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml(现用现配)；3.750μmol/L氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，(避光保存)；4.100μmol/LEDTA－Na2溶液：称取0.03721gEDTA－Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；5.20μmol/L核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml(避光保存)。三、实验步骤1.酶液提取取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。取1.5～2ml于1000rpm下离心20min，上清液即为SOD粗提液。2.显色反应取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下列加入各溶液：试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）0.05mol/L磷酸缓冲液1.5130mmol/LMet溶液0.313mmol/L750μmol/LNBT溶液0.375μmol/L100μmol/LEDTA－Na2液0.310μmol/L20μmol/L核黄素0.320μmol/L酶液0.052支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积3.0混匀后将1支对照管置暗处，其它各管于4000Lx日光下反应20min（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长）。3.SOD活性测定与计算至反应结束后，以不照光的对照管做空白，分别测定其它各管的吸光度。四、结果计算已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。SOD总活性＝(Ack－AE)×V/(Ack×0.5×W×Vt)上式中，SOD比活力＝SOD总活性蛋白质含量式中SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位／mg蛋白表示Ack照光对照管的吸光度AE样品管的吸光度V样品液总体积（ml）Vt测定时样品用量（ml）W样鲜重（g）蛋白质含量单位为：mg蛋白／g鲜重。超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定【实验原理】SOD是含金属辅基的酶，它催化以下反应：02-+02-+2H+H202+02由于超氧阴离子自由基02-寿命短，不稳定，不易直接测定SOD活性,而采用间接的方法。目前常用的方法有3种,包括氮蓝四唑(NBT)光化还原法，邻苯三酚自氧化法，化学发光法。本实验主要介绍光化还原法，其原理是：氮蓝四唑在蛋氨酸和核黄素存在条件下，照光后发生光化还原反应而生成蓝色甲腙，蓝色甲腙在560nm处有最大光吸收.。SOD能抑制NBT的光化还原，其抑制强度与酶活性在一定范围内成正比。试剂:1.50mmol/lpH7.8的磷酸缓冲液(PBS),含0.1mmol/lEDTA2.220mmol/l甲硫氨酸：称3.2824g甲硫氨酸\,用50mmol/lpH7.8的磷酸缓冲液定溶至100ml（现配现用）。3.1.25mmol/l氯化硝基四氮唑蓝（NBT）溶液（现配）：称NBT0.102g,用50mmol/lpH7.8的磷酸缓冲液(PBS)溶解定容至100ml.4.0.033mmol/l核黄素：称2.52mg用PBS溶解定容至200ml（遮光保存）。【实验步骤】1．酶液制备称取植物组织0.5g先加入2.5mlPBS，研磨匀浆后，再加入2.5mlPBS混匀，4℃下10000r/min离心15min上清液即为粗酶液。取部分上清液经适当稀释后用于酶活性测定。2.酶活性测定取10ml小烧杯7只,3只测定样品,4只作为对照，按下表加入试计:试剂用量(ml)终浓度(比色时)50mmol/l(PBS)220mmol/lMet1.25mmol/lNBT0.033mmol/l核黄素酶液总体积4.05、0.3、0.3、0.3、0.05、5.0、13mmol/l、75µmol/l、2.0µmol/l，对照以缓冲液代替酶液，将上述试剂混匀后，1只对照烧杯至于暗处，另3只对照烧杯和样品一起置于4000lx日光灯下反应20min（要求各管受光一致，温度高时时间缩短，温度低时可适当延长）。最后在560nm处测定反应液的光密度。以不照光的对照烧杯作参比，分别测定其他各管的光密度。3.蛋白含量的测定步骤1的上清液经适当稀释后用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白含量.【实验结果及计算】SOD活性单位是以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示。可按下式计算SOD活性：SOD总活性=SOD比活力=SOD总活性/蛋白质总浓度式中:SOD总活性以U/gFW,比活力单位以U/mg蛋白表示ACK为对照杯(光照)的光吸收值;AE为样品的光吸收值;V为样液总体积,V1为测定时样品用量,W为样重g.过氧化物酶（POD）活性测定【实验原理】过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中，在有H202存在条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色的4-邻甲氧基苯酚，可用分光光度计测生成物的含量来测定活性。【实验试剂】愈创木酚、30%过氧化氢、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L磷酸缓冲液（pH6.0）、反应混合液[100mmol/L磷酸缓冲液（Ph6.0）50mL，加入愈创木酚28uL,加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液溶解冷却后，加入30%过氧化氢19uL，混合均匀保存在冰箱中]【方法步骤】（1）、粗酶液的提取称取小麦叶片0.25g，加20mmol/LKH2PO42.5mL，于研钵中研成匀浆，以4000r/min离心10分钟，收集上清液保存在冷处，所得残渣再用20mmol/LKH2PO42.5mL提取一次，全并两次上清液，所得的即为粗酶提取液(酶活性过高，稀释10倍)。（2）、酶活性的测定取试管3只，于一只中加入反应混合液3mL，KH2PO41mL，作为校零对照，另外三只中加入反应混合液3mL，稀释后的酶液1mL（如表1），立即开启秒表，于分光光度计470nm波长下测量OD值，每隔1min读数一次（4min）。以每分钟表示酶活性大小，将每分钟OD值增加0.01定义为一个活力单位。表1紫外吸收法测定POD酶活性配置表管号S0（对照）S1（实验）S2（实验）反应混合液(ml)3.03.03.0KH2PO4(ml)1.00.00.0酶液(ml)0.01.01.04.结果计算以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以ΔA470/[min·g（鲜重）]表示之。也可以用每min内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位（u）表示。POD总活性[u/g(FW)]=∆A470×Vt/0.01×V1×t×FW式中：POD总活性以酶单位每克鲜重表示。其中△470=ACK-AE比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。ACK——照光对照管的吸光度。AE——样品管的吸光度。Vt——样品液总体积，mL。V1——测定时样品用量，mL。W——样品鲜重，g。蛋白质含量单位为mg/g。过氧化氢酶（CAT）活性的测定：紫外吸收法一、目的与要求过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。二、原理过氧化氢酶（catalase）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。过氧化氢在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液的吸光度（A240）随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。三、材料、仪器设备及试剂（一）材料：小麦或其它叶片（二）仪器设备：1.研钵；2.紫外分光光度计；3.离心机；4.恒温水浴；5.容量瓶。（三）试剂：1.0.2mol/LpH7.8磷酸缓冲液（pH7.8:0.2mol/LNa2HP0491.5ml;0.2mol/LNaH2P048.5ml）；2．0.1mol/LH2O2(30%的H2O2溶液5.68ml稀释至1000ml)二、实验步骤：1、酶液提取称取新鲜植物叶片或其它组织0.5g，置于研钵中，加入2～3ml4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀，将容量瓶置5℃冰箱中静置10min，取上清液在4000r/min下离心15min，上清液即为过氧化氢粗提液，5℃下保存备用。2、测定10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表1-1顺序加入试剂。25℃预热后，逐管加入0.6ml0.1mol/l的H2O2,每加完1管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，260nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测完后，按式（1-1）计算酶活性。表1-1紫外吸收法测H2O2样品测定液配制表管号S1S2S0空白粗酶液（ml）0.40.40.4(失活酶液)0.4（磷酸缓冲液）PH7.8磷酸缓冲液（ml）3.03.03.03.0蒸馏水（ml）2.02.02.02.03、结果计算以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（μ）。过氧化氢酶活性（μ.g-1min-1）=ΔA240*Vt/(0.1*Vl*t*FW)（1-1）式中ΔA240：As0-(As1+As2)/2;As0：加入失活酶液的对照管吸光值；As1，As2：样品管吸光值；Vt：粗酶提取液总体积（ml）；Vl：测定用粗酶提取液体积（ml）；FW：样品鲜重（g）；0.1：A240每下降0.1为1个酶活单位（μ）；t：过氧化氢到最后一次读数时间（min）