液相色谱-故障分析和维护.

液相色谱实用技术（一）使用注意事项及故障分析采用“HPLC”级溶剂避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂对试样有适宜的溶解度溶剂粘度要小流动相的选择液相色谱柱对流动相的要求液相色谱对流动相的要求除色谱柱对流动相对的要求外，还有∶与检测器匹配脱气避免卤素离子（不锈钢系统）溶剂的粘度细菌的生长等等•水的等级–纯化水–蒸馏水–去离子水波长(nm)纯化水去离子水因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高纯化水中去除了无机和有机的污染物吸光率流动相的选择水/MeOH梯度ODS柱鬼峰鬼峰的出现流动相的选择•溶剂的等级–HPLC级–优级纯–分析纯都经过蒸馏和0.45u的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂HPLC级经过0.2μm的过滤,且除去有紫外吸收的杂质微量分析、梯度洗脱流动相的选择甲醇乙睛正己烷分析纯级和HPLC级溶剂的吸光度比较图流动相的选择滤膜类型：聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐。醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶剂。尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以用于强酸，不适用于二甲基甲酰胺。再生纤维素滤膜：蛋白吸收低，同样适用于水溶性样品和有机溶剂溶剂的过滤流动相的脱气流动相脱气的目的使色谱泵的输液准确输液均匀准确，并且脉动减小保留时间及色谱峰面积的重现性提高提高检测的性能防止气泡引起的尖峰柱中气泡使流动相绕流，峰变形基线稳定，信噪比增加溶剂的紫外吸收本底降低保护色谱柱减少死体积防止填料的氧化除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡检测器气泡05101520250100200300400500600700mVmin脱气的目的防止由溶解（在液体中的）气体量的变动引起的检测信号不稳定1）示差折射率检测器：*使折射率变化2）UV检测器（200nm以下）：*溶解氧气有吸收3）荧光检测器：*溶解氧气有消光作用流动相脱气的方法加热简单，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流动相组成的变化抽真空同上，一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果超声波简单，但效果不理想。通惰性气体（一般用氦气）可保持连续脱气，多用于低压梯度脱气机（氟树脂膜的减压脱气）可保持连续脱气，多用于低压梯度样品处理使用流动相溶解样品--减少溶剂峰，尤其是组分峰靠近溶剂峰时尤为重要--保证样品在流动相中的溶解度，避免样品在系统中尤其在柱中产生沉淀·装置：高压梯度：用两台高压输液泵将两种溶剂输入低压梯度：在常压下将两种溶剂（或多元溶剂）混合，然后用高压输液泵将流动相输入到色谱柱中。梯度洗脱法优点：可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度梯度洗脱法的注意点溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差梯度混合的溶剂互溶性要好梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器）查看空白实验的数据。缓冲液选择缓冲液的步骤1.确定最佳分离状态时的流动相pH2.选择具有与流动相的pH相近的pKa的缓冲液（即使浓度稀也具有较强能力的缓冲液）3.确认检测波长下缓冲液是否有大的吸收（在波长210nm附近进行检测时，不能用醋酸和柠檬酸的缓冲液）缓冲液的使用使用前必须过滤使用后一定要进行清洗，以免造成腐蚀、磨损、阻塞分离的简单原则出得来；分得开；尽量快。液相色谱常见问题不要总是首先埋怨色谱柱!!!常见问题及其对策液相色谱常见问题类型A.压力异常（偏高、波动）B.漏液C.保留时间漂移D.基线问题（漂移、噪声）E.峰形异常现象：无压力，流动相不流动可能原因1、保险丝断或电源问题2、柱塞杆折断3、泵头内有空气或流动相不足4、单向阀损坏5、漏液6、压力传感器损坏(流动相流动正常，但无压力)压力异常现象：压力持续偏高或不断上升1、流速设定过高2、保护柱或柱子筛板堵塞3、流动相使用不当或有缓冲盐析出4、色谱柱选择不当5、进样阀损坏6、线路过滤器堵塞压力异常现象：压力持续偏低1、流速设定过低2、色谱柱选择不当3、柱温过高4、系统漏液压力异常压力异常现象：压力波动可能原因泵头中有气泡单向阀损坏柱塞密封圈损坏脱气不充分系统漏液使用了梯度洗脱漏液接头处漏液1、接头处松动2、接头磨损3、接头被污染4、部件不匹配漏液泵漏液1、单向阀松动2、泵密封损坏3、放空阀损坏4、接头松动（不要拧的太紧）检测器漏液可能原因1、流通池垫片损坏2、流通池透镜破碎3、手紧接头处漏液4、进样针尺寸不合适5、废液管堵塞6、流通池堵塞漏液可能原因1、柱温变化2、流动相组分变化3、色谱柱没有平衡4、流速变化5、泵中有气泡6、流动相选择不当7、键合相流失8、缓冲容量不够保留时间漂移基线漂移可能原因1、温度波动2、流动相不均匀(脱气，使用纯度更高的溶剂)3、流通池被污染或有气泡4、流通池窗口破裂5、流动相配比不当或流速变化6、柱子平衡（约30－60min）基线问题基线漂移可能原因7、流动相污染，变质或由低品质溶剂配成8、样品中有强保留的物质以馒头样峰被洗出9、检测器没有设定在最大吸收波长处基线问题基线噪声（规则的）可能原因1、流动相、泵、检测器中有气泡2、有地方漏液3、流动相混和不均匀4、温度影响（检测器和柱温差别太大）5、其他电子设备的影响基线问题基线噪声（不规则的）可能原因1、流动相污染、变质或由低质溶剂配成2、有地方漏液3、流动相各溶剂不相溶或混和不均匀4、流通池污染5、检测池能量不足6、系统内有气泡基线问题色谱峰分裂柱外死体积柱头填料污染部分阻塞进样阀密封问题化合物一起洗脱色谱峰展宽所有的色谱峰展宽•柱效降低•进样体积太大部分色谱峰展宽•上次进样洗脱的色谱峰•蛋白或聚合物等高分子量化合物色谱峰拖尾部分色谱峰拖尾•次级保留效应–残留硅醇基的作用•在大峰的尾部有小峰所有色谱峰拖尾•柱外效应•柱头污染•重金属离子•色谱柱填充不理想前伸峰色谱柱没有充分平衡在主峰前有小色谱峰负峰检测器输出信号的极性相反样品的吸收小于流动相，流动相不纯样品溶剂干扰示差折光检测器中样品的折射率较低进样中带入气泡可能原因1、样品过载2、样品溶剂选择不当变形峰鬼峰1、进样阀残余峰2、样品中未知物3、柱未平衡4、水污染5、三氟乙酸氧化液相色谱实用技术（二）色谱柱的使用及保养1.柱头螺丝2.过滤筛板3.色谱柱管刃环4.柱头压帽5.色谱柱柱管色谱柱结构2-1100-10-1850um10KVX500WD:11mm3微米多孔二氧化硅微球固定相基质类型Si-O-HSi-O-H硅胶颗粒表面硅羟基键合相Si-O-HSi-O-Si液相色谱固定相烷基键合固定相表面良好的色谱实验习惯拿到一根新色谱柱时，先仔细阅读说明书测定柱效（说明书+实际条件）保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录条件定期检测柱效定期检测仪器的谱带展宽色谱柱的使用及操作流动相的转换流速（压力）的变化幅度温度的变化幅度专用色谱柱∶样品及溶剂的要求记住∶拿到一根从未用过的色谱柱时一定要先看其使用说明！色谱柱的保养（一）样品方面除去微粒及杂质了解样品在流动相中的溶解度如样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶解度，防止其在流动相中析出了解样品与色谱柱的基质/填料是否相互作用色谱柱的保养（二）流动相方面除去微粒纯度的要求超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低缓冲液的pH值，在填料的允许范围内缓冲液（盐）的浓度溶剂：色谱纯，并与填料相匹配溶剂中的杂质含量流动相对样品的溶解度有机溶剂或水的比例在线的保护装置给色谱柱提供物理的保护除去样品及流动相中的颗粒给色谱柱提供化学的保护防止分析柱被化学污染装置在线过滤器自装填料保护柱预装保护柱在线过滤器In-LineFilter，部件号WAT084560防止颗粒在色谱柱头累积优点：基本不影响柱效在需要高柱效的分析时中常用（如：氨基酸分析）在色谱柱类型特殊时使用可更换的消耗品更换滤芯，部件号WAT005139(5/pkgs)更换垫圈，部件号WAT084567(10/pkgs)保护柱可避免化学污染。多数保护柱影响到整个色谱柱的柱效，特别是在用微柱时保护柱的种类普通自装填料的保护柱Waters的部件号，WAT084550，用户自装填料影响柱效同装填技术有关，柱效降低较大Guard-Pak预装保护柱Waters的部件号，WAT088141有各种填料的预装柱供选择，使用方便。填料容积较小，也引起柱效降低可换芯式保护柱新型的保护柱—SentryGuard适应的用户类型非常脏,非常复杂的样品本底生化样品,溶液环境样品食品不想做太多的固相萃取不想降低柱效新型的保护柱—SentryGuardSentryGuard的特点特点高质量,高效填料-不损失柱效增加分析柱效-增加适应范围20mm柱长-脏样品载荷能力大，能延长保护柱寿命手可拧紧接头，安装时不需要工具通用柱套-适用于所有的HPLC柱(3.9及4.6内径)整体式（对Waters柱）-使用方便，容易各种不同填料配合Waters柱SentryGuard的规格产品描述3.920mm柱长适应任何色谱柱，不需工具即可安装及更换可换柱芯式设计，提供各种填料:BondaPak:C18,phenyl,CN,NH2,SilicaNova-Pak:C18,C8,phenyl,CN,SilicaResolve:C18,C8,SilicaDelta-Pak:C18,C4Symmetry:C18,C8色谱柱的清洗对所做的样品要有充分的了解用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗硅胶柱的一般方法先用甲醇洗去极性杂质用干燥的二氯甲烷、正庚烷100~200ml依次活化键合相柱(烷基)的一般方法20倍柱体积的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次冲洗记住∶每种色谱柱可能有特定的方法一定要先看其使用说明！色谱柱的存放存放前的处理除去杂质、盐等等合适的存放溶剂避免色谱柱床的干枯避免机械震动防止细菌生长注意存放的温度色谱柱储存固定相储存溶剂反相(C18,C8,C4,etc.)甲醇或乙腈Phenyl甲醇或乙腈CN(反相)乙腈CN(正相)3:97Heptane:IPANH2,Diol,Silica3:97Heptane:IPA色谱柱常见毛病柱压过高多少才算高?不同色谱柱有差异不同系统有差异不同溶剂有差异不同温度有差异柱效低重复性差不出峰，回收率低柱压过高为什么柱压会过高微粒堵塞样品流动相密封垫柱床膨胀不可逆吸附细菌生长柱效低为什么柱效低色谱柱被污染过滤片部分堵塞样品、流动相或密封垫的细小颗粒造成的堵塞色谱柱内的死体积流动相pH值及组成不合适造成固定相流失流速急剧变化造成固定相物理损坏机械震动造成固定相产生裂缝柱床收缩或干枯重复性差、回收率低实验的重复性差色谱柱被污染流动相pH值及组成不合适造成键合相流失样品溶剂不同或样品本身不稳定回收率低，不出峰“不可逆”吸附固定相过强或流动相过弱非特异性吸附色谱柱以外的因素（一）“柱效”问题，不一定是色谱柱问题！仪器问题：连接不好造成死体积进样器检测器管路，连接口保护柱在线过滤器堵塞流动相问题：色谱柱未平衡好进样量太大色谱柱与仪器的联接除HP外，不同公司产品，其接头不同。处理不当时，会造成：色谱峰展宽（死体积）使柱效下降、或渗漏解决办法：自制相应的转换接头使用“通用”型接头（锥箍及螺母）这种锥箍在不锈钢管上是活动的，因此可以换接不同的色谱系统及色谱柱。从PhaseSeparations公司能得到一些PEEK工程塑料的接头，可用在所有类型的色谱柱上的。Waters色谱柱的联接Waters及PhaseSeparations锥箍及螺母相同，但锥箍前露出不锈钢管长度不同，其长度被称为：“stop-depth”Waters除Sp