液相色谱法的使用测试课程.

高效液相色谱法HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC一、概述气相色谱只适合分析较易挥发、且化学性质稳定的有机化合物，而HPLC则适合于分析那些用气相色谱难以分析的物质，如挥发性差、极性强、具有生物活性、热稳定性差的物质。通常将液相色谱法按分离机理分成吸附色谱法、分配色谱法、离子色谱法和凝胶色谱法四大类。其实，有些液相色谱方法并不能简单地归于这四类。类型吸附色谱吸附能，氢键异构体分离、族分离，制备分配色谱疏水分配作用各种有机化合物的分离、分析与制备排阻色谱溶质分子大小高分子分离，分子量及其分布的测定离子交换色谱库仑力无机离子、有机离子分析手性色谱立体效应手性异构体分离，药物纯化主要分离机理主要分析对象或应用领域亲和色谱生化特异亲和力蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析•高压：载液压力150~300kg/cm2•高速：载液流速1~10ml/min•高灵敏：Uv(10-9g)、Fl(10-11g)•高效：柱效106、3万塔板数/m特点：高压、高效、高速高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。二、高效液相色谱仪检测器高压输液泵高压输液泵输液系统进样系统分离系统检测系统数据处理系统贮液器高压泵梯度洗提装置馏份收集器记录仪检测器压力表HPLC仪流程图1、输液系统(1)高压输液泵高压输液泵在线脱气装置高压输液泵是液相色谱仪的关键部件，其作用是将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统。对于带在线脱气装置的色谱仪，流动相先经过脱气装置再输送到色谱柱。输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性。基本要求：流量准确可调。对于一般的分析，流动相的流速在0.5-2mL/min，输液泵的最大流量一般为5-10mL/min。输液泵的流量控制精度通常要求小于±0.5%。输液泵必须能精确地调节流动相流量，这可以通过电子线路调节电机转速或冲程长短来实现。流量的测定通常采用热脉冲流量计。主要部件之一，压力：150～350×105Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性输液泵按输出液恒定的因素分恒压泵和恒流泵。对液相色谱分析而言，输液泵的流量稳定性更为重要，因为流速的变化会引起溶质的保留值的变化，而保留值是色谱定性的主要依据之一。因此，恒流泵的应用更广泛。输液泵按工作方式分为气动泵和机械泵两大类。机械泵中又有螺旋传动注射泵、单活塞往复泵、双活塞往复泵和往复式隔膜泵。几种高压输液泵的性能比较名称恒流或恒压脉冲更换流动相梯度洗脱再循环价格气动放大泵恒压无不方便需两台泵不可高螺旋传动注射泵恒流无不方便需两台泵不可中等单活塞往复泵恒流有方便可可较低双活塞往复泵恒流小方便可可高隔膜往复泵恒流有方便可可中等(2)在线脱气装置在线脱气装置用于脱去流动相中的溶解气体，流动相先经过脱气装置再输送到色谱柱。流动相溶液溶解有氧气或混入了空气而形成气泡。气泡进入检测器后会在色谱图上出现尖锐的噪音峰。小气泡慢慢聚集后会变成大气泡，大气泡进入流路或色谱柱中会使流动相的流速变慢或出现流速不稳定，致使基线起伏。气泡一旦进入色谱柱，排出很费时间。在荧光检测中,溶解氧还会使荧光淬灭。溶解气体还可能引起某些样品的氧化或使溶液pH值发生变化。脱气方法液相色谱流动相脱气使用较多的是离线超声波振荡脱气、在线惰性气体鼓泡吹扫脱气和在线真空脱气。超声波振荡脱气：将配制好的流动相连容器放入超声水槽中脱气10-20min。这种方法比较简便。惰性气体鼓泡吹扫脱气：将气源（钢瓶）中的气体（氦气）缓慢而均匀地通入储液罐中的流动相中，氦气分子将其它气体分子置换和顶替出去，而它本身在溶剂中的溶解度又很小，微量氦气所形成的小气泡对检测无影响。真空脱气装置：将流动相通过一段由多孔性合成树脂膜制造的输液管，该输液管外有真空容器，真空泵工作时，膜外侧被减压，分子量小的氧气、氮气、二氧化碳就会从膜内进入膜外而被脱除。一般的真空脱气装置有多条流路，可同时对多个溶液进行脱气。（3）梯度洗脱装置通过两个输液泵流速的变化，改变流动相的洗脱能力，其作用与气相色谱的程序升温类似。ABABCC在进行多成分的复杂样品的分离时，经常会碰到前面的一些成分分离不完全，而后面的一些成分分离度太大，且出峰很晚和峰型较差。为了使保留值相差很大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并达到相互分离，往往要用到梯度洗脱技术。在液相色谱中流速（压力）梯度和温度梯度效果不大，而且还会带来一些不利影响，因此，液相色谱中通常所说的梯度洗脱是指流动相梯度，即在分离过程中改变流动相的组成或浓度。线性梯度：在某一段时间内连续而均匀增加流动相强度。阶梯梯度：直接从某一低强度的流动相改变为另一较高强度的流动相。梯度洗脱装置是解决溶液的混合问题。主要部件除高压泵外，还有混合器和梯度程序控制器。根据溶液混合的方式可以将梯度洗脱分为高压梯度和低压梯度。高压梯度：一般只用于二元梯度，即用两个高压泵分别按设定的比例输送两种溶液至混合器，混合器是在泵之后，即两种溶液是在高压状态下进行混合的。高压梯度系统的主要优点是，只要通过梯度程序控制器控制每台泵的输出，就能获得任意形式的梯度曲线，而且精度很高，易于实现自动化控制。缺点是使用了两台高压输液泵，使仪器价格变得更昂贵，故障率也相对较高，而且只能实现二元梯度操作。低压梯度：只需一个高压泵，与等度洗脱输液系统相比，就是在泵前安装了一个比例阀，混合就在比例阀中完成。因为比例阀是在泵之前，所以是在常压（低压）下混合，在常压下混合往往容易形成气泡，所以低压梯度通常配置在线脱气装置。如四元梯度系统：来自于四种溶液瓶的四根输液管分别与真空脱气装置的四条流路相接，经脱气后的四种溶液进入比例阀，混合后从一根输出管进入泵体。多元梯度泵的流路可以部分空置。2、进样系统通常采用六通伐进样：色谱柱色谱柱泵泵12进样进样器是将样品溶液准确送入色谱柱的装置，分手动和自动两种方式。进样器要求密封性好，死体积小，重复性好，进样时引起色谱系统的压力和流量波动要很小。现在的液相色谱仪所采用的手动进样器几乎都是耐高压、重复性好和操作方便的六通阀进样器，其原理与气相色谱中所介绍的相同。3、色谱柱Normalcolumn5-um、4.6-umNarrowborecolumn1-3umMicrocolumn1um色谱柱是实现分离的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能稳定。柱性能与柱结构、填料特性、填充质量和使用条件有关。直型，柱长10~100cm。分析柱内径2~5mm,制备柱6~10mm。色谱填料：经过制备处理后，用于填充色谱柱的物质颗粒，通常是5-10μm粒径的球形颗粒。色谱柱管：内部抛光的不锈钢管。典型的液相色谱分析柱尺寸是内径4.6mm，长250mm。色谱填料是由基质和功能层两部分构成。基质：又常称作载体或担体，通常制备成数微米至数十微米粒径的球形颗粒，它具有一定的刚性，能承受一定的压力，对分离不起明显的作用，只是作为功能基团的载体。常用来作基质的有硅胶和有机高分子聚合物微球。功能层：是通过化学或物理的方法固定在基质表面的、对样品分子的保留起实质作用的有机分子或功能团。如硅胶基质的冠醚大分子固定相，功能层冠醚分子吸附或键合在硅胶基质的表面。填料的物理结构：分为微孔型（或凝胶型）、大孔型（全多孔型）、薄壳型和表面多孔型四种类型。4、检测器用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。目前最常用的检测器主要有：紫外-可见检测器荧光检测器电化学检测器示差折光检测器蒸发光散射检测器质谱检测器检测器检测下限/(g/ml)线性范围选择性梯度淋洗主要特点紫外-可见光10-10103-104有可对流速和温度变化敏感；池体积可制作得很小；对溶质的响应变化大。荧光10-12-10-11103有可选择性和灵敏度高；易受背景荧光、消光、温度、pH和溶剂的影响。化学发光10-13-10-12103有困难灵敏度高；发光试剂受限制；易受流动相组成和脉动的影响。电导10-8103-104有不可是离子性物质的通用检测器；受温度和流速影响；不能用于有机溶剂体系。电化学10-10104有困难选择性高；易受流动相pH值和杂质的影响；稳定性较差。HPLC中常见检测器的基本特性蒸发光散射10-9无可可检测所有物质。示差折光10-7104无不可可检测所有物质；不适合微量分析；对温度变化敏感质谱10-10无可主要用于定性和半定量。原子吸收光谱10-10-10-13有可选择性高。等离子体发射光谱10-8-10-12有可可进行多元素同时检测。火焰离子化10-13-10-12104有可柱外峰展宽。应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：灵敏度高；线形范围宽；流通池可以很小（1mm×10mm，容积8μL）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。（1）紫外-可见检测器基于Lambert-Beer定律，即被测组分对紫外光或可见光具有吸收，且吸收强度与组分浓度成正比。很多有机分子都具紫外或可见光吸收基团，有较强的紫外或可见光吸收能力，因此UV-VIS检测器既有较高的灵敏度，也有很广泛的应用范围。由于UV-VIS对环境温度、流速、流动相组成等的变化不是很敏感，所以还能用于梯度淋洗。用UV-VIS检测时，为了得到高的灵敏度，常选择被测物质能产生最大吸收的波长作检测波长，但为了选择性或其它目的也可适当牺牲灵敏度而选择吸收稍弱的波长，另外，应尽可能选择在检测波长下没有背景吸收的流动相。直接紫外检测：所使用的流动相为在检测波长下无紫外吸收的溶剂，检测器直接测定被测组分的紫外吸收强度。多数情况下采用直接紫外检测。间接紫外检测：使用具有紫外吸收的溶液作流动相，间接检测无紫外吸收的组分。在离子色谱中使用较多，如以具有紫外吸收的邻苯二甲酸氢钾溶液作阴离子分离的流动相，当无紫外吸收的无机阴离子被洗脱到流动相中时，会使流动相的紫外吸收减小。柱后衍生化光度检测：对于那些可以与显色剂反应生成有色配合物的组分（过渡金属离子、氨基酸等），可以在组分从色谱柱中洗脱出来之后与合适的显色剂反应，在可见光区检测生成的有色配合物。二极管阵列检测器（diode-arraydetector,DAD）：以光电二极管阵列（或CCD阵列，硅靶摄像管等）作为检测元件的UV-VIS检测器。它可构成多通道并行工作，同时检测由光栅分光，再入射到阵列式接受器上的全部波长的信号，然后，对二极管阵列快速扫描采集数据，得到的是时间、光强度和波长的三维谱图。普通UV-VIS检测器是先用单色器分光，只让特定波长的光进入流动池。二极管阵列UV-VIS检测器是先让所有波长的光都通过流动池，然后通过一系列分光技术，使所有波长的光在接受器上被检测。紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图。光电二极管阵列检测器光源检测室光栅二极管阵列检测器（2）荧光检测器原理：许多有机化合物，特别是芳香族化合物、生化物质，如有机胺、维生素、激素、酶等，被一定强度和波长的紫外光照射后，发射出较激发光波长要长的荧光。荧光强度与激发光强度、量子效率和样品浓度成正比。有的有机化合物虽然本身不产生荧光，但可以与发荧光物质反应衍生化后检测。特点：有非常高的灵敏度和良好的选择性，灵敏度要比紫外检测法高23个数量级，特别适合于药物和生物化学样品的分析。对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；（3）电化学检测器（电导检测器conductivitydetector,CD）电导仪电极电极原理：基于离子性物质的溶液具有导电性，其电导率与离子的性质和浓度相关。电导检测器是离子色谱中必备的检测器。电导检测器的构成：由电导池、测量电导率所需的电子线路、变换灵敏度的装置和数字显示仪等几部分组成，电导池是其核心。电导池的结构：检测体积可达到微升甚至纳升级。其基本结构是在柱流出液中放置两根电极，然后通