淀粉酶的麸曲固态发酵生产

1实验二淀粉酶的麸曲固态发酵生产孟坤鹏学号：201213410310542012级生物技术专业三班1组摘要：目的：运用麸曲固态发酵方法生产淀粉酶。步骤：孢子悬液的制备，将孢子悬液浓度控制在107个/ml左右，然后在麸曲固态培养基上进行培养，待其颜色由白色、黄色，后变为褐色至淡绿褐色，背面无色时，表明发酵完成。用蒸馏水将酶与培养基一起溶解离心取上清后及得到酶粗品，运用硫酸铵盐析法进行酶的提纯，最后进行酶活力的测定。关键词固态发酵淀粉酶硫酸铵盐析法引言米曲霉是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶等。在淀粉酶的作用下将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子唐磊，如麦芽糖、葡萄糖等。真菌因其独特的生长、繁殖特点对生长条件的适应性已成为非常优异的农业加工副产物（麸皮）的降解菌和酶制剂生产菌。淀粉是植物最主要的贮藏多糖，也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本原料。淀粉酶属于水解酶类，是催化淀粉、糖原、糊精中糖苷键水解的一类酶的统称。此类酶广泛存在于动植物和微生物中。淀粉经淀粉酶作用后生成葡萄糖、麦芽糖等小分子物质而被机体利用。固态发酵法是微生物在没有或基本没有游离水的固态基质上的发酵方式方法，固态基质中气、液、固三相并存，即多孔性的固态基质中含有水和水不溶性物质。硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质，高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。本实验以麸皮为主要的发酵基质，豆粉饼为氮源，将米曲霉接种于富含淀粉的培养基中诱导发酵产生淀粉酶。其中，氮源是合成淀粉酶的原料，而淀粉可以诱导产量的增加，利用盐析沉淀法对粗酶进行分离纯化。酶活力测定：淀粉在淀粉酶的随机作用下可以被分解为葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，淀粉酶催化产生的还原糖能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。1实验内容1.1实验材料与试剂菌种：米曲霉（实验室提供）试剂：（1）75％乙醇（2）1LPBS缓冲液配方：pH7.4；磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.27g；磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.42g；氯化钠(NaCl)：8g；氯化钾(KCl)0.2g；加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L。（3）①1%淀粉溶液（称取1克可溶性淀粉，溶于100mlpH5.5柠檬酸缓冲液）；②pH5.6的柠檬缓冲液：A液（称取柠檬酸20.01克，溶解后定容至1L）B液（称取柠檬酸钠29.41克，溶解后定容至1L）取A液5.5ml、B液14.5ml混匀即为pH5.5柠檬酸缓冲液；③3，5-二硝基水杨酸溶液（称取3，5-二硝基水杨酸1.00克，溶于20ml1mol/L氢氧化钠中，加入50ml蒸馏水，再加入30克酒石酸钠，待溶解后，用蒸馏2水稀释至100ml，盖紧瓶盖保存）；④麦芽糖标准液（称取2克麦芽糖，溶于少量蒸馏水中，小心移入100ml容量瓶中定容）；⑤磷酸盐缓冲液（PH6.8）取0.2mol/L磷酸二氢钠溶液250ml，加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml，用水稀释定容至1000ml摇匀，即得。1.2实验器械设备：恒温培养箱、显微镜、离心机、水浴装置，高压蒸汽灭菌锅，电子天平、电炉、无菌操作台、721可见光分光光度计器皿：试管15个、玻璃棒2个、酒精灯1个、称量纸、胶头滴管1个、4个250ml锥形瓶、精密pH试纸、细胞计数板1个、盖玻片3个、陶瓷缸1个，1ml移液管2个、2ml移液管2个、培养皿8个、离心管8个、100ml烧杯2个、500ml烧杯2个、1000ml烧杯2个、胶皮手套1双、50ml容量瓶1个、100ml容量瓶2个、比色皿4个、10ml量筒1个、棉绳和报纸、纱布、棉花、涂布棒1个、试管架一个、洗耳球两个.等1.3实验方法1.3.1孢子悬液的制备[1]取包子颗粒溶于无菌水中制得浓度为107个/ml孢子悬液用血细胞计数法计数以确定每毫升孢子数，方法[2]：（1）视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释（斜面一般稀释100倍），以每小格的菌数可数为度。（2）取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。（3）将菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上（不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高），然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。（4）静置片刻，使细胞沉降到计数板上，不再随液体漂移。将血球计数板放置于显微镜的载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。（5）计数时若计数区是由16个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个大方格（即100小格）的菌数。如果是25个大方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央1个大方格的菌数（即80个小格）。为了保证计数的准确性，避免重复计数和漏记，在计数时，对沉降在格线上的细胞的统计应有统一的规定。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。即位于本格上线和左线上的细胞计入本格，本格的下线和右线上的细胞按规定计入相应的格中。见右图：即本格中计数细胞为3个。（6）每个样品重复计数2-3次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作），按公式计算出每mL（g）菌悬液所含细胞数量。16格×25格的血球计数板计算公式：细胞数/ml=100小格内细胞个数/100×400×10000×稀释倍数25格×16格的血球计数板计算公式：细胞数/ml=80小格内细胞个数/80×400×10000×稀释倍数1.3.2制备固体发酵培养基（麸曲）3制备固体发酵培养基（麸曲）配方[3]：（培养皿）麸皮8g豆粉饼2gK2HPO4`3H2O0.3%MgSO4`7H2O0.1%(NH4)2SO41%水10ml自然pH配制方法：依次称取配方的无机药品，并依次溶解混合，再加入豆粉饼，最后加入麸皮搅拌均匀。分装到8个培养基中，压实按匀。分装完成后完成后，高压灭菌锅121℃灭菌20min。（三）接种每个培养基接1ml（具体量按计数结果来，大概每个培养基接107个）孢子悬液，并用涂布棒涂布均匀。（无菌操作）培养放在恒温培养箱中30℃恒温培养72h（具体时间根据米曲霉的生长状态。最佳形态1.3.3酶的提取分离和纯化1、粗酶液的提取[4]在发酵结束后，在培养基加蒸馏水100ml，捣碎并搅拌均匀，40℃水浴浸提1h，用无菌纱布过滤（或抽滤），然后在5000r/min条件下离心20min,取上清液作为粗酶液。2、淀粉酶的初步分离纯化（盐析沉淀法）硫酸铵盐析1）发酵液上清装至1支烧杯中。2）加硫酸铵至烧杯中，对照25℃硫酸铵饱和度配置表，使其饱和度60%。在加硫酸铵时需缓慢的加入，同时不断的轻柔搅拌（否则局部浓度过高会使酶失活）使硫酸铵完全溶解；3）室温静置2h，出现白色沉淀4）离心，得到沉淀，再用PBS缓冲液冲洗2次，并离心，得到较纯的酶。（饱和硫酸铵的配制方法：见附录一）1.3.4酶活力的测定[5]1.3.4.1、麦芽糖标准曲线的制作取7支干净的具塞刻度试管，编号，按表1加入试剂：试剂管号123456麦芽糖标准液（mL）0.10.20.30.40.50.6蒸馏水（mL）0.90.8070.60.50.4在50℃水浴中预热3min后，加入2mL浓度为1%的淀粉溶液在50℃水浴中反应5min，立即加入已在沸水浴中预热的4mL3,5-二硝基水杨酸试剂，摇匀后放入沸水浴中反应10min另取1支25mL的试管，加入1mL蒸馏水，同法操作，作空白实验。在波长500nm处测定溶液的吸光度[6]，以浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线41.3.4.2、淀粉酶液的制备吸取上述制备的淀粉酶10mg，放入50mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶稀释液，用于淀粉酶总活力的测定。1.3.4.3、酶活力的测定：实验采用的方法是：取样液，用pH6.8的磷酸盐缓冲液稀释5倍。取稀释后的酶液1mL，在50℃的水浴中预热3min，立即加入2mL1%的淀粉溶液，在50℃的水浴中反应5min，立即加入已在沸水浴中预热的4mL3,5-二硝基水杨酸试剂，摇匀后放入沸水浴中反应10min，在波长500nm处分别测定各自的吸光度。根据标准曲线酶的浓度。本实验规定：50℃时5min内水解淀粉释放1mg麦芽糖所需的酶量为1个酶活力单位(U)。计算酶活力公式为：酶活力单位(U)=C酶×V酶×n酶式中：C酶——酶液中麦芽糖的浓度；V酶——提取酶液的总体积；n酶——酶液的稀释倍数。2.结果与分析2.1粗酶液反应后吸光度值吸光度值10.02320.02230.024平均值0.0232.2提纯后酶液反应的吸光度值5图中指针所指为提纯后的酶吸光度值10.03720.03630.038平均值0.037酶活力单位(U)=C酶×V酶×n酶=0.1656×7×1=1.15922.3固态发酵过程固态培养第一天6固态培养第二天固态培养第三天2.4结果分析通过实验结果可知在50℃时5min内水解淀粉释放1mg麦芽糖所需的酶量为1个酶活力单位(U)。其大小为1.1592.此次测得的酶的活力过小。其可能原因如下：（1）当我们培养基培养到第三天时通过照片可以看出，酶还没有长成熟，仍处于生长阶段，所以分泌的淀粉酶可能导致活性不高；（2)在酶提纯时所得到的纯酶过少，在5min内不能发挥很大的作用;（3)硫酸铵盐析法时，硫酸铵浓度的控制没有经过很好的探究实验，只是根据所查文献配的，所以可能不是最佳的浓度，所以得到的纯酶少。3.思考题3.1酶活力测定时为什么要保温5min？7答;50℃为淀粉酶反应的最适温度，保温五分钟能够使酶充分与淀粉发生反应。使实验结果更准确。3.2要使本实验更精确应如何优化？答：（1）本次实验中菌种涂布可以更均匀一点；（2）酶活力测定时准确计时，在时间到达前要做好下一步准备，减少误差；（3）酶活力测定提前将酶液和淀粉溶液预热至50度，避免温度变化的影响（4）本次实验未测含水率，下次要考虑实验室条件，及时对实验方案做出调整。（5）提前做好硫酸铵盐析法最适浓度的测定实验，使提纯达到更好的纯度。（6）固态培养时严格要求：待其颜色由白色、黄色，后变为褐色至淡绿褐色，背面无色时，表明发酵完成。然后再制作孢子悬液。4.参考文献[1]贺胜英,王玉双,杨云娟等.固体发酵酸性淀粉酶高效产酶实验的研究[J].2011,3:97.[2]http//[3]卢福芝,钱丰,韦江露等.米曲霉固态发酵产淀粉酶条件优化的研究.河池学院学报[J],2013,33(1):14-18.[4]苏小军,熊兴耀,谭兴和等.黑曲霉AF-1固态发酵生产生淀粉酶的条件优化[J].湖南农业大学学报,2009,35(2):209.[5]靳利娥,吕光成.发芽黄豆β-淀粉酶活力的测定与比较(J).2004.06.026.附录一硫酸铵溶液饱和度计算表8