淋巴细胞的分离技术

淋巴细胞的分离技术（一）材料与试剂1．淋巴细胞分层液有两种：（1）聚蔗糖—泛影葡胺液：聚蔗糖（polysucrosesolution）,商品名Ficoll，分子量400000，多配制成40±1％（W/V）水溶液，也有干粉出售。应用时，用蒸馏水配制9％溶液。泛影葡胺溶液(Megluminidiatrizoici)，商品名Vrografin，结构式为3，5—二乙酰氨基2，4，6三碘苯甲酸1—去氧—甲氨基山梨醇。含量为60％或75％，每安瓶为20ml装，常用于人的脏器造影。应用时，取60％泛影葡胺原液20ml，加双蒸馏水15.38ml，即为33.9％泛影葡胺。1.077±0.001聚蔗糖—泛影葡胺的配制：9％聚蔗糖液24份33.9％泛影葡胺液10份混合即可。必要时，可测比重。需要备用，可用G5漏斗过滤除菌或114.3℃高压灭菌15min，4℃保存。一般可保存3个月。如要配制不同比例的分层液，可按下列公式计算：式中dm为分层液的比重，d1和d2分别为9％聚蔗糖和33.9％泛影葡胺的比重，V1和V2分别为它们的体积。如需配制1.077比重的聚蔗糖—泛影葡胺的分层液，则9％的聚蔗糖和33.9％的泛影葡胺的比例应为100︰46.3。（2）泛影葡胺—右旋糖酐（dextran）液34％泛影葡胺液10份60％右旋糖酐液12.5份混合，即为比重1.07～1.09的分层液。分装于棕色瓶中，4℃冰箱保存备用。2．3％的明胶液称取明胶3g，溶于0.9％的灭菌生理盐水，终体积100ml，114.3℃高压灭菌10min，冷却后4℃冰箱保存，临用时37℃预热10min。3．Hank’s液。（二）操作方法1．取抗凝血，自然沉降，如是马属动物的血液，可直接直立试管架上，让其自然沉降1h，取上层血浆。如是牛、羊血液，由于其血沉速度非常慢，可加等量3％明胶液，混匀后让其自然沉降，1h后取上层血浆。2．2000r/min离心10min，弃上清。3．沉淀用Hank’s液混悬后，再2000r/min离心10min。4．重复步骤3一次，再用细胞营养液将白细胞制成悬液。此液含有整个白细胞群，包括粒细胞、淋巴细胞、单核细胞和部分红细胞。可供白细胞计数用。5．取2ml细胞分层液于离心管内，同时用毛细吸管吸取约2ml的血浆（自然沉降1h的上层血浆）轻轻加入分层液上，直接加抗凝血也可。6．以水平转子离心机2000r/min离心20min。离心后，可见分成多层，最下层是红细胞，中间层是分层液，最上层是血浆。在血浆层与分层液之间是一薄层较致密的白色层，即为单个核细胞层。7．用毛细吸管插入到单个核细胞层并吸取该层，放入另一试管中。8．以Hank’s液洗涤、离心，最后配制成适当的白细胞浓度。必要时可计数。（三）注意事项1．血浆或血液加入分层液中时要小心，缓慢不要打乱液层、不要摇动。也可以将分层液加入到血浆的上层。2．保持淋巴细胞的活性是非常重要的，所以一般情况下，是现采血，马上进行分离。3．经过分层液分离的淋巴细胞层，实际上是单个核细胞层，包括单核细胞，不包括粒细胞。欲分离出纯的淋巴细胞，则按下法除去单核细胞，或收获单核细胞。