第13章甾体激素类药物的分析

第十一章甾体激素类药物的分析基本结构：环戊烷骈多氢菲C20C21ABCD12345678910111213141516171819环上双键的表示方法：用“”表示,双键的位置写在的右上角。双键位置45414251,45651055(10)环上取代基构型表示方法：＊构型：与母核连接的取代基,指向环平面的前面时,为构型.用实线表示“———”＊构型：与母核连接的取代基,指向环平面的背面时,为构型.用虚线表示“”按药理作用分类：甾体激素肾上腺皮质激素性激素雄性激素及蛋白同化激素孕激素雌激素OHOOHOCH2OHHHH肾上腺皮质激素氢化可的松OHOOHOHFHOCH3OHCH3醋酸地塞米松1.均有21个碳原子2.A环△4-3-酮基,UV、与羰基试剂反应3.C17位上有a-醇酮基,具还原性一、结构与性质雄性激素及蛋白同化激素睾酮OOHHHHO苯丙酸诺龙1.雄性激素母核有19个碳原子,蛋白同化激素C10位上一般无角甲基,母核有18个碳原子2.A环△4-3-酮基3.C17位上有β-羟基,或由它们形成的酯OOHMeMethyltestosterone甲基睾酮HHH17位加甲基作用更强OOHHHHOCH3丙酸睾酮酯化吸收减慢，作用时间长。雄性激素及蛋白同化激素主要活性基团性质△4–3–酮UV、与羰基试剂反应C17–β–羟基可成酯COHHHCH3O孕激素黄体酮1.母核有21个碳原子2.A环△4-3-酮基3.C17位上有甲酮基OOOHHHO醋酸甲地孕酮孕激素主要活性基团性质△4–3–酮UV、与羰基试剂反应C17–甲酮基与亚硝基铁氰化钠反应雌性激素炔雌醇1.母核有18个碳原子,C10无角甲基2.A环为苯环,C3位上有酚羟基3.C17位上有β-羟基OHHO1718OHHOCCH雌二醇雌激素主要活性基团性质A环为3–OH苯环UV、与重氮苯磺酸盐反应C17–乙炔基与AgNO3反应C17–羟基可成酯小结甾体激素碳原子数A环17位取代基肾上腺皮质激素214-3-酮-醇酮基雄性激素194-3-酮-OH-CH3孕激素214-3-酮甲酮基雌激素18苯环C3-酚OH-OH-C≡CH二、鉴别试验（一）与强酸的呈色反应甾体激素类药物呈色H2SO4H3PO4HClO4HCl与硫酸呈色操作简便，依颜色与荧光可区别，反应灵敏，为各国药典所用。如中国药典：氢化可的松，取本品2mg，加硫酸2ml溶解，放置5分钟，显棕黄至红，并显绿色荧光，将此溶液倾入10ml水中，即变黄色至红色，同时有少量絮状沉淀生成。与硫酸显色反应显色荧光加水稀释炔雌醇橙红黄绿絮状↓玫红醋酸可的松黄或微无褪色并澄带橙色清(二)官能团的反应1C17–α–醇酮基还原性A.呈色反应肾上腺皮质激素药物呈色四氮唑盐OHˉ例如:中国药典中醋酸泼尼松的鉴别方法：本品1mg，加乙醇2ml溶解，10%氢氧化钠试液2滴。氯化三苯四氮唑试液1ml，显红色。肾上腺皮质激素药物Cu2O↓橙红色碱性酒石酸铜B.沉淀反应Ag↓黑色氨制硝酸银多伦试剂斐林试剂甾酮类激素药物呈色羰基试剂2.C3–酮基和C20–酮基＃常用的羰基试剂：2,4-二硝基苯肼、异烟肼、硫酸苯肼OOHNCONHNH2HClCONHNOHN异烟腙（黄色）睾酮OCCH3O2NCONHNH2HCl黄体酮CONHNCCH3NHNOCNN异烟双腙（黄色）具有甲酮基或活泼亚甲基的甾体激素类药物呈色亚硝基铁氰化纳间二硝基酚芳香醛3.甲酮基黄体酮蓝紫色亚硝基铁氰化纳其他甾体淡橙色不显色亚硝基铁氰化纳亚硝基铁氰化钠是黄体酮专属而灵敏的反应COCH3O黄体酮]NOCNFe[OHH2O2+-4Fe5CNNOCHCOO蓝紫色有机氟Fˉ有机破坏有机氯Clˉ4.有机卤素茜素氟蓝硝酸亚铈硝酸—硝酸银AgCl↓蓝紫色OOOHOHCH2NCH2COOHCH2COOH茜素氟蓝OOOHOCH2NCH2COOCeCH2COOFOH蓝紫色F-Ce铈药典规定地噻米松磷酸钠用氧瓶燃烧法处理，使有机结合的氟转变成无机的氟离子，在pH4.3条件下与茜素氟蓝试液和硝酸亚铈试液反应生成蓝紫色的水溶性配位化合物。脂肪链上的氯可水解脱落中国药典中氯倍他索的鉴别方法：取本品少许，加乙醇1ml,混合，加热，加硝酸2ml，摇匀，加硝酸银数滴，即显白色沉淀。氯在母核上（丙酸倍氯米松）不易脱落，要用氧瓶燃烧法处理，再按氯化物的鉴别试验进行鉴别。雌激素类药物红色偶氮染料重氮苯磺酸5.酚羟基含炔基的甾体激素白色的银盐沉淀硝酸银6.炔基的沉淀反应RCCHAgNO3RCCAg↓炔雌醇OHCCHHOOHCCAgHO白3AgNO盐酸氨基脲苯丙酸诺龙△℃约180..pm缩氨基脲衍生物(三)制备衍生物测定m.p.1.缩氨基脲的生成2.酯的水解丙酸睾酮醇制的氢氧化钾游离睾酮熔点为150°～156°3.肟的生成羰基与羟胺生成肟，测熔点如炔诺孕酮与盐酸羟胺醋酸钠反应生成炔诺孕酮肟，生成物的熔点为：195℃4.酯的生成酚羟基与苯甲酰氯生成酯，测熔点例如：炔雌醇与苯甲酰氯反应，生成物苯甲酸酯的熔点为：201℃不少药物是C17或C21上羟基的酯类。药物中酯结构的鉴别，一般先行水解，产生相应的羧酸，再根据羧酸的性质来鉴别。（四）水解产物的反应KOHOCOCHR醇制香OCOCHCHCHSOHOHHC戊酸戊酸雌二醇醇制NaOHH特臭己酸己酸羟孕酮醇制OHH特臭△４-3-酮约240nm苯环约280nmOCCCCCCCCC（五）UV法规定最大吸收波长最大吸收波长处的吸收度某两个吸收波长处吸收度的比值CH3300～3000cm-1HC3000～2700cm-1OC1900～1650cm-1CC1650～1450cm-11000～650cm-1CH（六）IR法3750～3300cm-1νOH（七）TLC法主要用于甾体激素类药物制剂的鉴别方法：对照品法要求供试品溶液所显主斑点的颜色和位置与对照品溶液的主斑点相同。（八）HPLC法主要用于甾体激素类药物制剂的鉴别（如：醋酸氟轻松软膏）方法：对照品法要求在含量测定项下记录的色谱图中，供试品峰的tR与对照品峰的tR一致。三、特殊杂质检查（一）其他甾体1.定义与标示药物结构不同的甾体化合物都称为“其他甾体”2.来源原料、中间体、异构体、降解产物3.特点（1）可能存在多个甾体杂质（2）结构类似4.方法（具有一定分离能力）TLC法（高低浓度对比法）判定方法：规定杂质斑点数目规定杂质斑点颜色氢化可的松检查其他甾体取本品加氯仿-甲醇（9：1）制成3.0mg/ml的溶液作为供试液，精密量取适量，加氯仿-甲醇（9：1）稀释成0.06mg/ml的溶液作为对照液；照薄层色谱法，各取5μl，分别点于同一硅胶G板上，以氯仿-甲醇（97:3）为展开剂，展开后晾干，在105℃干燥10分钟，放冷，喷以碱性四氮唑盐试%%.%限量液，立即检视，供试品溶液如显杂质斑点，不得多于2个，其颜色与对照液的主斑点比较，不得更深。12（2）HPLC法（主成分自身对照法）判定方法：规定杂质峰数目规定杂质峰面积取本品适量，精密称定，以甲醇为溶剂，配制成每1ml含1mg的溶液（1）与每1ml含0.02mg的溶液（2），用含量测定项下的方法和溶液，取5μl注入液相色谱仪，调整仪器灵敏度，使主成分峰高度达记录仪的满量程。再分别取溶液（1）黄体酮检查其他甾体和溶液（2）各10μl，进样。记录至主成分峰保留时间的1.5倍。溶液（1）显示的杂质峰数不得超过1个，其面积不得大于溶液（2）主峰面积的3/4。供试溶液：溶液（1）1mg/ml对照溶液：溶液（2）0.02mg/ml(二)硒来源合成中用二氧化硒(SeO2)脱氢nmA环己烷苯并苯硒二唑二氨基萘,Se,..pHSeSe盐酸羟胺氧瓶燃烧原理剧毒（三）有机溶剂残留量的检查甲醇第二类溶剂≤0.3%GC法丙酮第三类溶剂≤0.5%地塞米松磷酸钠检查甲醇和丙酮内标法（四）游离磷酸盐地塞米松磷酸钠氢化可的松磷酸钠倍他米松磷酸钠氢化泼尼松磷酸钠对照品法检查游离磷酸地塞米松磷酸钠精密称取本品20mg，置25ml量瓶中，加水15ml溶解，精密加钼酸铵硫酸试液2.5ml与1-氨基-2-萘酚-4-磺酸溶液1ml，加水至刻度，摇匀，在20℃放置30～50分钟，照分光光度法，在740nm处测定吸收度，与对照液4.0ml同法处理的吸收度比较，不得更大。（对照液0.035mg/mlKH2PO4）POKHPOH%.供试品中游离磷酸盐按磷酸计算的限量：第四节、含量测定根据甾体激素药物的官能团和整个分子的特征，可以采用比色法、紫外分光光度法、荧光法、气相色谱法和液相色谱法测定其含量甾体激素类药物常含有结构相似的其他甾体杂质，对利用结构特征设计的比色法有干扰（一）HPLC法USP、BP、JP均采用RP－HPLC（大多内标法）特点：用样量少，灵敏度高，分离效果好，测定速度快。二UV法△４-3-酮240nm（±）肾上腺皮质激素雄性激素和蛋白同化激素孕激素苯环280nm（±）雌激素三比色法（一）异烟肼比色法1原理：C3－酮基及某些其他位置上的酮基能在酸性条件下与羰基试剂异烟肼缩合，形成黄色的异烟棕，在一定波长处具有最大吸收HCl（缩合）C3－酮基异烟肼异烟棕（黄色）CONHNOHN异烟腙（黄色）2.方法对照品法℃异烟肼挥去乙醇对照液供试液ACHCl暗45′醋酸地塞米松软膏含量测定对照液：精密称取醋酸地塞米松对照品25mg，置100ml量瓶中，加无水乙醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取5ml，用无水乙醇稀释至50ml，摇匀。供试液：精密称取本品适量（约相当于醋酸地塞米松2.5mg），置烧杯中，加无水乙醇约25ml，置水浴中加热，搅拌，使醋酸地塞米松溶解，再置冰浴中冷却，滤过，滤液置100ml量瓶中，同法提取三次，滤液并入量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。测定法：精密量取上述溶液各10ml，分别置具塞试管中，置水浴中蒸去乙醇，残渣中加氯仿10ml，振摇，使残渣溶解，各精密加0.1%异烟肼甲醇溶液（取异烟肼0.5g，加盐酸0.63ml，加甲醇使溶解成500ml）10ml，摇匀，置55℃暗处保温45分钟，取出，放冷，用氯仿稀释至25ml。摇匀，在415nm的波长处分别测定吸收度，计算即得。3.讨论（1）溶剂的选择异烟肼盐酸盐→甲醇、乙醇无水甲醇无水乙醇酸、异烟肼的量(2)盐酸:异烟肼=2:1A最大盐酸的浓度为0.0074mol/L异烟肼的浓度为0.00365mol/L也可以使用0.0037mol/L的硫酸若使用醋酸，则将其浓度增大，约为4.4mol/L样品:异烟肼=1:8→ν↑（3）水分、温度、O2与光线的影响①含水量↑→腙水解↑→A↓→%↓②温度升高，反应速度加快③不挥发溶剂、不吸收水分时→O2与光线对反应无影响（4）关于反应的专属性反应速度C3=O＞C17=O、C20=OC11=O不反应对C3－酮基最敏感。有色甲瓒四氮唑盐醇酮基COH-[还原]1原理肾上腺皮质激素类药物C17-α－醇酮基，具强还原性，在强碱性溶液中能将四氮唑盐还原成有色的甲瓒。生成的颜色随所用的试剂和条件的不同而不同（二）四氮唑比色法2.四氮唑盐的种类氯化三苯四氮唑（TTC）也称红四氮唑蓝四氮唑（BT）CNNNN+Cl-e2CNNNNH红四氮唑三苯甲瓒↓深红nm~max490480Cl-+CNNNNOCH3+-ClCNNNNOCH3蓝四氮唑（BT）OHe4HCNNNNOCH3HCNNNNOCH3双甲瓒（暗蓝）nmmax525供试液：精密称取本品4g（约相当于醋酸泼尼松龙20mg），置烧杯中，加无水乙醇约30ml，置水浴上加热，充分搅拌，使醋酸泼尼松龙溶解，再置冰浴中冷却，滤过，滤液置100ml量