第15章核酸与核酸的研究方法

2012年王镜岩版《生物化学》考研参考笔记1————安雨（整理）1第十五章核酸核酸是遗传物质1868年瑞士Miesher.从脓细胞的细胞核中分离出可溶于碱而不溶于稀酸的酸性物质。间接证据：同一种生物的不同种类的不同生长期的细胞，DNA含量基本恒定。直接证据：T2噬菌体DNA感染E.coli用35S标记噬菌体蛋白质，感染E.coli，又用32P标记噬菌体核酸，感染E.coliDNA、RNA的分布（DNA在核内，RNA在核外）。第一节核酸的化学组成核酸是一种线形多聚核苷酸，基本组成单位是核苷酸。结构层次：核酸核苷酸磷酸核苷戊糖碱基组成核酸的戊糖有两种：：D-核糖和D-2-脱氧核糖，据此，可以将核酸分为两种：核糖核酸（RNA）和脱氧核糖核酸（DNA）P330表5-1两类核酸的基本化学组成一、碱基1.嘌呤碱：腺嘌呤鸟嘌呤2.嘧啶碱：胞嘧啶尿嘧啶胸腺嘧啶P331结构式3.修饰碱基植物中有大量5-甲基胞嘧啶。E.coli噬菌体中，5-羟甲基胞嘧啶代替C。稀有碱基：100余种，多数是甲基化的产物。DNA由A、G、C、T碱基构成。RNA由A、G、C、U碱基构成。2012年王镜岩版《生物化学》考研参考笔记2————安雨（整理）2二、核苷核苷由戊糖和碱基缩合而成，糖环上C1与嘧啶碱的N1或与嘌呤碱的N9连接。核酸中的核苷均为β-型核苷P332结构式腺嘌呤核苷胞嘧啶脱氧核苷DNA的戊糖是：脱氧核糖RNA的戊糖是：核糖三、核苷酸核苷中戊糖C3、C5羟基被磷酸酯化，生成核苷酸。1、构成DNA、RNA的核苷酸P333表5-32、细胞内游离核苷酸及其衍生物①核苷5’-多磷酸化合物ATP、GTP、CTP、ppppA、ppppG在能量代谢和物质代谢及调控中起重要作用。②环核苷酸cAMP（3’，5’-cAMP）cGMP（3’，5’-cGMP）它们作为质膜的激素的第二信使起作用，cAMP调节细胞的糖代谢、脂代谢。③核苷5’多磷酸3’多磷酸化合物ppGpppppGppppApp④核苷酸衍生物HSCoA、NAD+、NADP+、FAD等辅助因子。GDP-半乳糖、GDP-葡萄糖等是糖蛋白生物合成的活性糖基供体。第二节DNA的结构一级：脱氧核苷酸分子间连接方式及排列顺序。二级：DNA的两条多聚核苷酸链间通过氢键形成的双螺旋结构。三级：DNA双链进一步折叠卷曲形成的构象。2012年王镜岩版《生物化学》考研参考笔记3————安雨（整理）3一、DNA的一级结构DNA的一级结构是4种脱氧核苷酸（dAMP、dGMP、dCMP、dTMP）通过3/、5/-磷酸二酯键连接起来的线形多聚体。3/、5/-磷酸二酯键是DNA、RNA的主链结构。P334图5-1书写方法：5/→3/：5’-pApCpTpG-3’，或5’…ACTG…3’（在DNA中，3/-OH一般是游离的）在DNA分子中，不变的骨架成分磷酸二酯键被逐渐省略，真正代表DNA生物学意义的是碱基的排列顺序。遗传信息贮存在DNA的碱基排列顺序中，生物界生物的多样性即寓于DNA分子4种核苷酸千变万化的精确的排列顺序中。二、DNA的二级结构1953年，Watson和Crick根据Chargaff规律和DNANa盐纤维的X光衍射数据提出了DNA的双螺旋结构模型。1、Watson-Crick双螺旋结构建立的根据①Chargaff规律1950年a.所有DNA中，A=T，G=C且A+G=C+T。P334表5—4。b.DNA的碱基组成具有种的特异性，即不同生物的DNA皆有自己独特的碱基组成。c.DNA碱基组成没有组织和器官的特异性。d.年龄、营养状况、环境等因素不影响DNA的碱基组成。②DNA的Na盐纤维和DNA晶体的X光衍射分析。相对湿度92%，DNA钠盐结晶，B—DNA。相对湿度75%，DNA钠盐结晶，A—DNA。Z—DNA。生物体内DNA均为B—DNA。Franklin的工作2、Watson-Crick双螺旋结构模型P335图5—22012年王镜岩版《生物化学》考研参考笔记4————安雨（整理）4a.两条反平行的多核苷酸链绕同一中心轴相缠绕，形成右手双股螺旋，一条5’→3’，另一条3’→5’b.嘌呤与嘧啶碱位于双螺旋的内侧，磷酸与脱氧核糖在外侧。磷酸与脱氧核糖彼此通过3/、5/-磷酸二酯键相连接，构成DNA分子的骨架。宽1.2nm宽0.6nm大沟小沟深0.85nm深0.75nmc.螺旋平均直径2nm每圈螺旋含10个核苷酸碱基堆积距离：0.34nm螺距：3.4nmd.两条核苷酸链，依靠彼此碱基间形成的氢链结合在一起。碱基平面垂直于螺旋轴。A=T、G=CP336图5—4碱基互补原则具有极重要的生物学意义，DNA的复制、转录、反转录等的分子基础都是碱基互补。3、稳定双螺旋结构的因素①碱基堆积力（主要因素）形成疏水环境。②碱基配对的氢键。GC含量越多，越稳定。③磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子或组蛋白的正离子之间形成离子键，中和了磷酸基上的负电荷间的斥力，有助于DNA稳定。④碱基处于双螺旋内部的疏水环境中，可免受水溶性活性小分子的攻击。三、DNA二级结构的不均一性和多型性（一）DNA二级结构的不均一性1、反向重复序列（回文序列）DNA序列中，以某一中心区域为对称轴，其两侧的碱基对顺序正读和反读都相同，即对称轴一侧的片段旋转180°后，与另一侧片段对称重复。较长的回文结构，在某些因素作用下，可形成茎环式的十字结构和发夹结构。功能还不完全清楚，但转录的终止作用与回文结构有关。较短的回文序列，可作为一种特别信号，如限制性核酸内切酶的识别位点。2、富含AT的序列高等生物中，A+T与C+G的含量差不多相等，但在它们的染色体的某一区域，AT含量可能很高。在很多有重要调节功能（不是蛋白质编码区）的DNA区段都富含AT碱基对。特别是在复制起点和2012年王镜岩版《生物化学》考研参考笔记5————安雨（整理）5启动的Pribnow框的DNA区中，富含AT对。这对于复制和转录的起始十分重要，因为GC对有三个氢键，而AT对只有两个氢键，此处双键易解开。（二）DNA二级结构的多型性P339表5-6A-、B-、Z-DNA的比较1、B—DNA：典型的Watson-Crick双螺旋DNA右手双股螺旋每圈螺旋10.4个碱基对每对螺旋扭角36°螺距：3.32nm碱基倾角：1°2、A-DNA在相对湿度75%以下所获得的DNA纤维。A-DNA也是右手双螺旋，外形粗短。RNA-RNA、RNA-DNA杂交分子具有这种结构。3、Z-DNA左手螺旋的DNA。天然B-DNA的局部区域可以形成Z0-DNA。4、DNA三股螺旋在多聚嘧啶和多聚嘌呤组成的DNA螺旋区段，序列中有较长的镜像重复时，可形成局部三股螺旋，称H-DNA。镜像重复：TAT配对C+GC酸对DNA的三链结构常出现在DNA复制、重组、转录的起始或调节位点，第三股链的存在可能使一些调控蛋白或RNA聚合酶等难以与该区段结合，从而阻遏有关遗传信息的表达。四、环状DNA生物体内有些DNA是以双链环状DNA的形式存在，包括：2012年王镜岩版《生物化学》考研参考笔记6————安雨（整理）6某些病毒DNA某些噬菌体DNA某些细菌染色体DNA细菌质粒DNA真核细胞中的线粒体DNA、叶绿体DNA1、环形DNA的不同构象P340图5-8松驰环、解链环、负超螺旋（1）、松弛环形DNA线形DNA直接环化（2）、解链环形DNA线形DNA拧松后再环化（3）、正超螺旋与负超螺旋DNA线形DNA拧紧或拧松后再环化，成为超螺旋结构。绳子的两股以右旋方向缠绕，如果在一端使绳子向缠紧的方向旋转，再将绳子两端连接起来，会产生一个左旋的超螺旋，以解除外加的旋转造成的胁变，这样的超螺旋叫正超螺旋。如果在绳子一端向松缠方向旋转，再将绳子两端连接起来，会产生一个右旋的超螺旋，以解除外加的旋转所造成的胁变，这样的超螺旋称负超螺旋。对于右手螺旋的DNA分子，如果每圈初级螺旋的碱基对数小于10.4，则其二级结构处于紧缠状态，是正超螺旋。如果每圈初级螺旋的碱基对数大于10.4，则其二级结构处于松缠状态，是负超螺旋。2、环形DNA的拓扑学特性以260bp组成的线形B-DNA为例，螺旋周数260/10.4=25。P340图25-8松驰环、解链环、负超螺旋①连环数（L）DNA双螺旋中，一条链以右手螺旋绕另一条链缠绕的次数，以L表示。松驰环：L=25解链环：L=23超螺旋：L=23②缠绕数（T）DNA分子中的Watson-Crick螺旋数目，以T表示2012年王镜岩版《生物化学》考研参考笔记7————安雨（整理）7松驰环T=25解链环T=23超螺旋T=25③超螺旋周数（扭曲数W）松驰环W=0解链环W=0超螺旋W=-2L=T+W④比连环差（λ）表示DNA的超螺旋程度λ=（L—L0）/L0L0是指松驰环形DNA的L值天然DNA的超螺旋密度一般为-0.03~-0.09，平均每100bp上有3-9个负超螺旋。负超螺旋DNA是由于两条链的缠绕不足引起，很易解链，易于参加DNA的复制、重组和转录等需要将两条链分开才能进行的反应。3、拓扑异构酶此酶能改变DNA拓扑异构体的L值。①拓扑异构酶酶I（拧紧）能使双链负超螺旋DNA转变成松驰形环状DNA，每一次作用可使L值增加1，同时，使松驰环状DNA转变成正超螺旋。②拓扑异构酶酶II（拧松）能使松驰环状DNA转变成负超螺旋形DNA，每次催化使L减少2，同时能使正超螺旋转变成松驰DNA。五、染色体的结构1、大肠杆菌染色体大肠杆菌染色体是由4.2×106bp组成的双链环状DNA分子，约3000个基因。大肠杆菌DNA结合蛋白：每个细胞H两个28KD的相同亚基30000个二聚体HU两个各9KD的不同亚基40000个二体聚体HLP117KD的亚基20000个单体P3KD的亚基未知这些DNA结合蛋白，使4.2×106bp的E.coli染色体DNA压缩成为一个手脚架形结构，结构中心是多种DNA结合蛋白，DNA双螺旋分子有许多位点与这些蛋白结合，形成约100个小区，每个小区的DNA2012年王镜岩版《生物化学》考研参考笔记8————安雨（整理）8都是负超螺旋，一个小区的DNA有两个端点被蛋白质固定，每个小区相对独立。图用极微量的DNA酶I处理时，只能使少量小区的DNA成为松驰状态，而其它小区仍然保持超螺旋状态。2、真核生物染色体主要由组蛋白和DNA组成。组蛋白是富含碱性a.a(Lys、Arg)的碱性蛋白质，根据Lys/Arg比值不同，可分为H1、H2A、H2B、H3、H4五种，均为单链蛋白质，分子量11000-21000。H2A、H2B、H3、H4各两分子对称聚集成组蛋白八聚体。146bp长度的DNA双螺旋盘绕在八聚体上形成核小体。核小体间DNA长度15-100bp（一般60bp）其上结合有H1图2H2A、2H2B、2H3、2H4组蛋白八聚体146bpDNA核小体串联染色质折叠染色体DNA（直径2nm）盘绕组蛋白八聚体上，结合H1，压缩比1/7核小体（一级结构）螺旋化，压缩比1/6螺线管（二级结构）再螺旋化，压缩比1/40超螺线管（三级结构）折叠，压缩比1/5染色单体（四级结构）总压缩比：1/8400~1/10000六、DNA的生物学功能首次直接证明DNA的遗传功能的是Avery的肺炎双球菌转化实验。P3421~4Avery的肺炎双球菌转化实验2012年王镜岩版《生物化学》考研参考笔记9————安雨（整理）9第三节RNA的结构一、RNA的一级结构RNA是AMP、GMP、CMP、UMP通过3/、5/磷酸二酯键形成的线形多聚体。P343图5-10RNA基本结构①组成RNA的戊糖是核糖②碱基中RNA的U替代DNA中的T，此外，RNA中还有一些稀有碱基。③天然RNA分子都是单链线形分子，只有部分区域是A-型双螺旋结构。双螺旋区一般占RNA分子的50%左右。二、RNA的类型细胞中的RNA，按其在蛋白质合成中所起的作用，主要可分为三种类型。核糖体RNArRNA转运RNAtRNA信使RNAmRNA此外，真核生物细胞中有少量核内小RNA（smallnuclearRNAsnRNA）P344