湖工酶工程第三章

第三章酶的分离工程酶工程第三章酶的分离工程酶的分离工程是指酶的提取和分离纯化的过程，即将酶从生物细胞或培养物等含酶原料中提取出来，再与杂质分开，从而获得能满足使用需求的一定纯度的酶制品的过程。酶的分离纯化过程一般包括四个阶段：预处理、粗分离、细分离、成品化。第三章酶的分离工程酶工程第一节预处理胞内酶(合成后分布在细胞内的酶）；胞外酶（合成后分布在细胞外的酶）一、发酵液的预处理加热降低发酵液的粘度，使某些杂质变性，使发酵液容易过滤。凝聚在溶液中加入电解质，使非目标产物凝聚成较大的颗粒或胶团，更容易沉降或过滤。第三章酶的分离工程酶工程絮凝利用高分子聚合物的桥联作用，将胶体粒子联结成网状絮凝团的过程。聚丙烯酰胺添加助滤剂使胶体粒子吸附在固体助滤剂上，随助滤剂一起被截留。硅藻土和珍珠岩第三章酶的分离工程酶工程二、细胞破碎（一）机械破碎法实验室操作方法工业上使用方法捣碎法研磨法匀浆法撞击破碎机法大容量球磨机法高压匀浆器法第三章酶的分离工程酶工程（二）物理破碎法温差法：反复冻融法压差法：高压冲击法、突然降压法、渗透压变化法超声波法：空穴作用（三）化学破碎法有机溶剂破碎法：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等表面活性剂破碎法：Triton、Tween等第三章酶的分离工程酶工程（四）酶促破碎法外加酶法：溶菌酶、葡聚糖酶、几丁质酶、纤维素酶自溶法：温度、pH、离子强度等第三章酶的分离工程酶工程第二节酶的提取一、酶的提取方法（一）盐溶液提取法0.02~0.5mol/L（二）酸溶液提取法pH2~6酵母醇脱氢酶0.5mol/L磷酸氢二钠溶液；枯草杆菌碱性磷酸酶0.1mol/L氯化镁溶液胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶0.12mol/L硫酸溶液第三章酶的分离工程酶工程（三）碱溶液提取法pH8~12（四）有机溶剂提取法乙醇、丙酮、丁醇细菌L-天冬酰胺酶pH11.0~12.5碱性溶液琥珀酸脱氢酶、胆碱酯酶、细胞色素氧化酶用丁醇提取第三章酶的分离工程酶工程二、影响酶提取的主要因素（一）温度在不影响酶活力的前提下，适当提高温度（二）pH在保持酶稳定的前提下，远离酶的等电点（三）搅拌适当搅拌，但速度不能过快（四）污染低pH和低温下操作（五）提取液的体积原料体积3~5倍，少量多次第三章酶的分离工程酶工程第三节酶的分离纯化将目标产物酶与各种杂质成分相互分离的过程成为酶的分离纯化。目的：①除杂；②浓缩。原理：利用目标产物酶与各种杂质成分在物理、化学及生物学性质上的差异。评价指标：①收率；②纯化倍数；③重现性。检测方法：快速、方便、有效。方法：离心、沉淀、过滤与膜分离、萃取、层析、电泳。第三章酶的分离工程酶工程一、离心分离（一）离心机的种类用途：制备、分析及分析—制备两用离心机结构：管式、碟片式、转鼓式、吊兰式转速：低速转速≤8000r/min，相对离心力≤1×104g高速转速(1~2.5)×104r/min，相对离心力1×104~1×105g超速转速(2.5~12)×104r/min，相对离心力5×105g第三章酶的分离工程酶工程（二）离心分离方法差速离心：通过控制不同的转速，使不同颗粒大小的物质先后沉降，从而使不同颗粒大小的物质得以分离。密度梯度离心：最大密度小于目标物质等密度梯度离心：最大密度大于于目标物质密度梯度离心等密度梯度离心第三章酶的分离工程酶工程二、沉淀分离通过改变某些条件或添加某种试剂，使酶的溶解度降低，以沉淀的形式从溶液中析出，从而与其它溶质分离的技术。蛋白质分子表面是由一系些分布不均匀的荷电区、亲水区和疏水区所组成。蛋白质是两性电解质，在不同pH条件下带有不同的电荷。蛋白质溶液是胶体溶液，维持其胶体溶液稳定性的因素有两个：①蛋白质分子周围的水化层；②同种电荷的排斥作用。第三章酶的分离工程酶工程（一）盐析沉淀法通过加入高浓度无机盐，使酶的溶解度降低，从而使之从溶液中沉淀析出的过程或现象称为盐析沉淀。①破坏了蛋白质分子表面的水化层，使蛋白质分子表面的疏水基团暴露，蛋白质分子通过疏水作用相互聚集而沉淀；②无机盐中和了蛋白质分子表面的电荷，使蛋白质分子之间的电荷排斥作用消失，蛋白质分子的聚集作用增强。机理：第三章酶的分离工程酶工程IlogS盐溶盐析00.15~0.2MlogS=β-KsIKs—盐析常数，与蛋白质和盐的种类有关。Ks越大，盐析效果越好。β—与蛋白质种类及温度和pH有关的常数。常用的无机盐：(NH4)2SO4，NaCl，Na2SO4影响因素：无机盐的种类和浓度，温度，pH值第三章酶的分离工程酶工程（二）等电点沉淀法通过调节溶液的pH值，使其达到酶或蛋白质的等电点，从而使酶或蛋白质从溶液中沉淀析出的过程或现象称为等电点沉淀。等电点时，蛋白质分子所带的净电荷为零，蛋白质分子之间的同种电荷排斥作用消失，蛋白质分子的聚集作用增强。机理：第三章酶的分离工程酶工程注意：调pH值，避免局部过酸或过碱，以防止酶变性或失活；只适用于疏水性较强的蛋白，亲水性很强的蛋白，单靠等电点不能使其完全沉淀。特点：操作简便，无需后续脱盐操作。第三章酶的分离工程酶工程（三）有机溶剂沉淀法通过加入一定浓度的有机溶剂（乙醇、丙酮），使酶或蛋白质从溶液中沉淀析出的过程或现象称为有机溶剂沉淀法。降低水溶液的介电常数，蛋白质分子之间的引力增加，蛋白质分子相互聚集而沉淀。机理：第三章酶的分离工程酶工程特点：优点：有机溶剂密度较低，沉淀易于分离；沉淀物不需进行脱盐处理；有机溶剂易蒸发除去；沉淀物色泽较好。缺点：有机溶剂容易导致蛋白质变性失活，且易燃易爆，故必须在低温条件下进行操作，且沉淀物应迅速与有机溶剂分离，以减少酶的变性失活率。第三章酶的分离工程酶工程（四）选择性变性沉淀法选择一定的条件使溶液中的杂蛋白变性沉淀而目标蛋白不受影响的方法称为选择性变性沉淀法。选择性变性方式：热变性，pH变性和有机溶剂变性注意：先充分了解目标蛋白的稳定性，严格控制条件，使杂蛋白变性沉淀的同时，目标蛋白不受影响。第三章酶的分离工程酶工程（五）其它沉淀方法非离子性聚合物沉淀法：PEG机理：与有机溶剂相似聚电解质沉淀法：机理：絮凝作用第三章酶的分离工程酶工程三、过滤与膜分离利用过滤介质或膜的膜孔截留作用使不同大小、不同形状和不同特性的物质相互分离的技术或方法。（一）粗滤利用过滤介质截留悬浮液中直径大于2μm的颗粒，从而使固液分离的技术或方法。过滤介质：滤纸、滤布、纤维、陶瓷等过滤方法：常压过滤、加压过滤、减压过滤第三章酶的分离工程酶工程（二）微滤和超滤微滤：用于悬浮液中粒径为0.2~2um大小颗粒的分离。操作压力：0.05~0.5MPa过滤介质：高分子薄膜、微孔陶瓷膜超滤：用于溶液中大小为2nm~0.2um的溶质分子的相互分离。操作压力：0.1~0.5MPa第三章酶的分离工程酶工程超滤膜要求：较大的透过速率和较好的选择性；一定的机械强度；耐热、耐腐蚀及不易染菌；耐高温灭菌；廉价。膜材料：聚丙烯晴、醋酸纤维素、硝酸纤维素、聚砜、聚偏氟乙烯。膜装置：板框式、圆管式、螺旋卷式、中空纤维式、毛细管式超滤特点：分离过程中无相变化，可在常温和低压下操作，条件温和，对酶蛋白活性影响较小；设备简单，成本低，能耗少；工艺流程简单，易于操作和管理，适于大量样品的处理。只能用于粗分离，分辨率较低，只能将分子量相差10倍以上的分子完全分开。第三章酶的分离工程酶工程（三）透析以浓度差作为传质推动力，利用透析膜的膜孔截留作用使不同大小溶质分子相互分离的技术或方法。特点：以浓度产作为传质推动力，透过通量很小，分辨率不高，主要用于样品的脱盐，且局限于实验室，难以大规模使用。透析示意图第三章酶的分离工程酶工程四、萃取分离利用样品中各组分在两相中溶解度或分配比的不同来实现目标产物的分离和纯化的技术或方法称为萃取分离。根据两相的状态，萃取可分为：液夜萃取、液固萃取、液气萃取、超临界流体萃取。液夜萃取：有机溶剂萃取、双水相萃取、反胶团萃取、液膜萃取。第三章酶的分离工程酶工程（一）双水相萃取某些亲水性高分子聚合物在水溶液中混合达到一定的浓度后，可自发形成分别富含有两种不同聚合物的两个相，由于两个相都是水溶液（相），称为双水相系统。利用双水相系统进行的萃取称为双水相萃取。特点：可用于酶或蛋白质等生物大分子的萃取，操作条件温和，不易导致目标产物的变性失活，可从细胞破碎液中直接萃取胞内目标产物，相平衡时间短。成本较高，选择性不高，分离后产物浓度低。第三章酶的分离工程酶工程成相物A成相物B聚丙稀乙二醇甲氧基聚乙二醇、葡萄糖、磷酸钾、硫酸葡聚糖钠盐聚乙二醇聚乙烯醇、聚蔗糖、葡聚糖、磷酸钾、硫酸镁、硫酸钠、甲酸钠、酒石酸钾钠聚丙二醇甲基聚丙二醇、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基葡聚糖、葡聚糖甲基纤维素葡聚糖、羧甲基葡聚糖、羧甲基葡聚糖钠盐甲氧基聚乙二醇磷酸钾乙基羟乙基纤维素葡聚糖羟丙基葡聚糖葡聚糖聚蔗糖葡聚糖聚吡咯烷酮甲基纤维素表3-4常见的双水相体系第三章酶的分离工程酶工程1.萃取原理利用样品中不同溶质组分在两相中溶解度或分配比的不同来实现不同组分的相互分离。2.影响因素（1）成相聚合物的种类和浓度。（2）成相聚合物的分子量。（3）电解质、温度和pH。（4）酶的分子量、电荷性以及外加电场等。第三章酶的分离工程酶工程（二）反胶团萃取微水相反胶团有机相水相反胶团萃取示意图表面活性剂分子在有机溶剂中达到一定的浓度后，可自发地形成疏水性尾部朝外亲水性头部朝内，含有水分子内核，纳米级透明的热力学稳定的聚集体，称为反胶团。利用反胶团进行的萃取称为反胶团萃取。第三章酶的分离工程酶工程1.萃取原理利用酶或蛋白质等电解质与反胶团中表面活性剂分子亲水性头部所带荷电基团之间的静电作用以及反胶团的空间排阻作用来促使目标产物向反胶团中溶解。2.操作过程微水相反胶团有机相水相（1）正萃取（2）反萃取第三章酶的分离工程酶工程3.影响因素（1）水相pH值。（2）离子强度。（3）表面活性剂和助表面活性剂。（4）温度和相比。（5）蛋白质的种类和浓度。第三章酶的分离工程酶工程五、层析分离又称色谱分离，利用溶液中不同的溶质组分与固定相之间相互作用的不同，使得不同的溶质组分随流动相通过固定相时的移动速度不同，从而使不同的溶质组分得以相互分离。层析方法分离依据层析方法分离依据凝胶层析分子量与形状亲和层析亲和力吸附层析吸附力层析聚焦等电点分配层析分配系数疏水层析弱疏水作用离子交换层析离子交换反相层析强疏水作用表3-5层析分离方法第三章酶的分离工程酶工程梯度混合器样品贮液器层析柱恒流泵蛋白核酸检测仪自动部分收集器记录仪柱层析过程装置示意图第三章酶的分离工程酶工程（一）凝胶层析又称凝胶过滤层析、凝胶渗透层析、分子筛层析、分子排阻层析。以各种颗粒状的多孔凝胶作为固定相，利用溶质分子量的差异进行分离的层析分离法，称为凝胶层析。凝胶颗粒常用的凝胶介质：葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等特点：操作简单，样品回收率高，不需要再生。分离速度慢，上样量有限。第三章酶的分离工程酶工程混合样品小分子中等分子大分子凝胶层析示意图1.层析原理在凝胶层析柱中具有凝胶颗粒内部微孔和凝胶颗粒间隙两种孔道结构。当样品溶液流过层析柱时，小分子溶质可通过扩散进入凝胶内部微孔中，移动速度慢，而大分子溶质只能在凝胶颗粒间隙移动，移动速度快，从而使得不同分子量的溶质相互分离。第三章酶的分离工程酶工程2.操作过程（1）装柱均匀，无气泡（2）上样适量，一般为床体积的10%，不超过30%（3）洗脱恒定洗脱，流速要慢第三章酶的分离工程酶工程（二）吸附层析以各种固体吸附剂作为固定相，利用溶质分子与吸附剂之间吸附作用力的差异进行分离的层析分离法，称为吸附层析。特点：吸附剂种类丰富，可再生，设备简单，成本低。但分辨率相对较低。常用吸附剂：硅胶，硅藻土，活性炭，羟基磷灰石，氧化铝，磷酸钙，碳酸盐，陶土等。常用洗脱剂：石油醚，环己烷，四氯化碳，三氯甲烷，甲苯，苯，二氯甲烷，乙醚、丙酮、正丙醇、乙醇、甲醇、水、吡啶、乙酸等。第三章酶的分离工程酶工程1.层析原理溶质与固体吸附剂之间主要依靠范德华力产生吸附作用。2.洗脱方法（1）溶剂洗脱法洗脱展开法（2）置换洗脱法