溶菌酶的应用及其酶学性质的研究

《高级微生物学》——文献综述2015级生物学专业黄君15107100002029溶菌酶的应用及其酶学性质的研究黄君（大连工业大学生物工程学院辽宁大连116034）摘要：本文旨在对溶菌酶的发展及应用并对纯化的溶菌酶的酶学性质研究,研究表明,该酶相对分子质量约为16000,对溶壁微球菌的最适作用温度为35℃,最适作用pH6.5,在45℃以下和pH4.0-8.0都有较好的稳定性,并与常见金属离子和化学试剂有良好的配伍性｡与通常从蛋清中提取的溶菌酶相比较,从海参中分离纯化的溶菌酶具有广谱杀菌功能,即对常见的革兰氏阴性菌和阳性菌细胞壁均有溶解作用｡关键词：发展及应用；溶菌酶;酶学性质Theapplicationoflysozymeandenzymologypropertiesresearch(BiologicalEngineering,DalianUniversityofTechnology,Dalian116034)Abstract:Thispaperaimedtothedevelopmentandapplicationoflysozymeandthepurificationoflysozymeenzymologyproperties，Theresultsshowedthatitsmolecularweightwasestimatedasapproximately16000.TheoptimalpHandtemperatureagainstMicrococcuslysodleikticuswerepH6.5and35℃,respectively.Andtheenzymewasstableattemperaturebelow45℃andpH4.0-8.0.Thepurifiedlysozymeshowedbroad-spectrumagainstmanybacteria,notonlyinhibitingthegrowthofGram-positivebacteria,butalsoGram-negativebacteriaaswellasanumberofpathogens.Keywords:Developmentandapplication;cloudpointextraction;purification引言溶菌酶,又称细胞壁水解酶,专门作用于细菌细胞壁的骨架物质一肽聚糖,广泛存在于高等动植物组织及分泌物､原生动物､昆虫和各种微生物中[1]｡溶菌酶本身是一种蛋白质,安全性能高,在食品､医药､生物等领域应用广泛[2-4]一般商品溶菌酶多由蛋清中提取,仅对革兰氏阳性菌有作用｡为此,数十年来国内外相继开展了一系列新型溶菌酶的开发研究工作[5].海洋极端生物作为产酶资源正成为一个新的研究热点｡由于海洋的特殊环境,使海洋生物所产的酶具有一些较之相应的陆生动植物及微生物产生的酶更为独特的性质｡本文作者提取了海参消化道中的溶菌酶,并对提取条件和酶学性质进行了深入的探讨｡本研究对海参溶菌酶的生产及应用具有重要的意义｡目前实际应用已商品化的溶菌酶是鸡蛋清溶菌酶，该酶一般从鸡蛋清中直接提取，产量低且成本较高。另外，鸡蛋清溶菌酶仅对革兰氏阳性菌有作用，应用上有一定的局限性。因此，近些年来国内外相继开展了一系列新型溶菌酶的研究工作[5]。海洋高盐、高压、低温等独特的环境使海洋生物产的溶菌酶具有了陆地生物来源的溶菌酶所不具备的特殊性质，所以对这类酶的关注和研究也越来越多[6-7]。1.溶菌酶研发背景：抗生素是人类应用最广泛的抗菌药物，不仅用于临床，也广泛用于畜禽饲养和农业方面。在过去的50多年中，由于饲用抗生素在养殖中的长期使用导致大量耐药菌株的产生，且病原菌抗药性逐年增强，致使疗效下降，剂量提高，造成动物疾病越防越难防，越治越难治，给养殖业造成很大的损失和危害。同时也给全人类的健康造成严重的影响。因此，世界卫生组织于1994年就细菌耐药性的监测结果给全世界提出了警示：细菌对抗生素产生的耐药性正在以惊人的速度增加，而现在的抗生素药物正在失去原来的疗效。因此寻求广谱、高效的新一代饲用抗菌药物已成为迫在眉睫的摆在人类面前的课题。澳大利亚昆士兰大学医学系博士生导师、高级研究员王雯禾博士（1993年毕业于英国剑桥大学达尔文学院获微生物营养学博士学位），一直致力于生命科学的研究和发展，历经十多年的研究发现：酶广泛存在于生物体内，参与新陈代谢等多种生理功能，其中对微生物细胞壁具有水解功能的抗菌酶，如溶菌酶lysozyme能够溶解微生物细胞壁而使微生物死亡，而且溶菌酶lysozyme在人和动物的唾液、眼泪、乳汁以及肌体组织中大量存在，是人和动物自身重要的免疫因子，与人和动物的健康息息相关[9]。溶菌酶lysozyme的溶菌（杀菌）作用与传统的抗生素药物相比，具有对某一病原菌所有血清型都有效的优点，克服了一种抗生素只能预防一种或其中一种血清型病原菌的不足，更不存在药物残留和耐药性的问题。王雯禾博士认为，溶菌酶lysozyme作为畜禽、水产饲料添加剂在替代抗生素，控制耐药菌，生产绿色肉蛋奶食品方面是最佳的选择。并多次鼓励和支持国内年轻的科学家、学者，致力于这一伟大的、划时代的、对全人类的健康有杰出贡献的产品的开发和研究。并于2003年10月推出最早用于防治动物疾病的产品--溶菌酶系列,由于它不但能溶解（杀死）细菌，增强动物的免疫能力，而且还能和病毒结合使病毒失活，所以它作为预防动物疾病的新型饲料添加剂，正在动物疾病防治的许多领域被广泛应用。2.溶菌酶生产原理--一种基因克隆酶早在上世纪九十年代早期，荷兰科学家就研制出phyA基因工程菌，成为全世界第一个基因克隆菌的研究成果，作为一个伟大的研究成果在生物领域被迅速推广和使用。溶菌酶是我们澳洲的研究专家团将来源于健康动物体内的溶菌酶利用分子生物学技术对其进行基因克隆重组进入受菌体，筛选优选优良菌种，通过生物发酵和生物提取工艺以及冷冻干燥技术产生的一种水溶性溶菌（杀菌）蛋白酶。3.溶菌酶的主要应用3.1医学应用可作为一种具有杀菌作用的天然抗感染物质。有抗菌、抗病毒、止血、消肿止痛及加快组织恢复功能等作用。临床用于慢性鼻炎、急慢性咽喉炎、口腔溃疡、水痘、带状疱疹和扁平疣等。也可与抗菌药物合用治疗各种细菌和病毒感染。口服和肌注均有效。口服，3～5片/次(肠溶片含10mg)，3次/日。口含，1片/次(口含片含20mg)，4～6次/日。外用：以1%～2%溶液滴注、涂擦或直接喷粉。肌注，50mg～100mg/次，1～2次/日。滴眼：用2%溶液。3.1.2副作用偶有较轻的过敏反应。氯化溶菌酶医疗效果更广，有浓痰分散、出血抑制、组织修复、消炎镇痛、抗过滤性病毒等作用，因而用氯化溶菌酶的制药有消炎消痔、治感冒、皮肤病及眼、鼻、喉等用药.3.2食品应用可作为防腐剂，它的主要功用是水解细菌细胞壁，在细胞内，则对吞噬后的病原菌起破坏作用.该酶对革兰氏阳性菌中的枯草杆菌、耐辐射微球菌有分解作用。对大肠杆菌、普通变形菌和副溶血性弧菌等革兰氏阴性菌也有一定程度溶解作用，其最有效浓度为0.05%。与植酸、聚合磷酸盐、甘氨酸等配合使用，可提高其防腐效果。4.主要应用领域1．溶菌酶是一种无毒、无副作用的蛋白质，又具有一定的溶菌作用，因此可用作天然的食品防腐剂[11]。现已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐；还可以添入乳粉中，使牛乳人乳化，以抑制肠道中腐败微生物的生存，同时直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增殖。2．溶菌酶作为一种存在于人体正常体液及组织中的非特异性免疫因素，具有多种药理作用，它具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的功效，目前医用溶菌酶其适应症为出血、血尿、血痰和鼻炎等。3．溶菌酶具有破坏细菌细胞壁结构的功能，以此酶处理G+细菌得到原生质体，因此，溶菌酶是基因工程、细胞工程中细胞融合操作必不可少的工具酶。5.化学机理溶菌酶能有效地水解细菌细胞壁的肽聚糖，其水解位点是N-乙酰胞壁酸(NAM)的1位碳原子和N-乙酰葡萄糖胺(NAG)的4位碳原子间的β-1.4糖苷键。肽聚糖是细菌细胞壁的主要成份，它是由NAM、NAG和肽“尾”(一般是4个氨基酸)组成，NAM与NAG通过β-1.4糖苷键相连，肽“尾”则是通过D-乳酰羧基连在NAM的第3位碳原子上，肽尾之间通过肽“桥”(肽键或少数几个氨基酸)连接，NAM、NAG、肽“尾”与肽“桥”共同组成了肽聚糖的多层网状结构，作为细胞壁的骨架，上述结构中的任何化学键断裂，皆能导致细菌细胞壁的损伤。对于革兰氏阳性菌（G+），如藤黄微球菌、枯草杆菌或溶壁微球菌等，与革兰氏阴性菌(G-)，如大肠杆菌、变形杆菌、痢疾杆菌、肺炎杆菌等，其细胞壁中肽聚糖含量不同，G+细菌细胞壁几乎全部由肽聚糖组成，而G-细菌只有内壁层为肽聚糖，因此，溶菌酶对于破坏G+细菌的细胞壁较G-细菌强[12]。6.溶菌酶的酶学性质的研究6..I溶菌酶的分离纯化CPE浓缩溶菌酶经CM52纤维素阳离子交换柱层析分离后,盐洗脱峰为活性峰｡收集有活性的洗脱液脱盐浓缩后,上样于SephadexG-75凝胶过滤层析柱｡收集活性峰透析浓缩后作为纯化样品使用｡纯化过程中阳离子交换柱层析纯化效果最为明显,纯度提高了11.3倍,去除了大部分杂蛋白,最终溶菌酶经纯化比活达到3026.1U/rag,纯度提高了18.7倍,活力回收为46.0%｡6.1.2溶菌酶相对分子质量的测定将纯化得到的溶菌酶以SDS-PAGE进行分析,纯化样品为单一条带｡由标准蛋白可知该酶相对分子质量约为15962｡6.2溶菌酶的理化性质研究6.2.1.pH对酶活性的影响在不同pH缓冲溶液中和不同温度下测定相对酶活｡可知,该溶菌酶最适作用条件为:pH6.5,35℃｡在高于和低于35℃时酶活下降比较缓慢,5℃时仍保持一定活性,相对酶活为25%｡根据Margsin等的定义,通常把最适催化温度在30℃左右､在0℃左右仍有一定催化效率的酶称为低温酶｡因此该溶菌酶为低温酶[7-8].6.2.2溶茵酶的稳定性采用不同pH和温度测定溶菌酶的稳定性｡该溶菌酶(25℃)pH6.5时最稳定,在pH4.O~8.0稳定性均较好,相对酶活在60%以上｡结果表明溶菌酶(pH6.5)在小于45℃时有较好的热稳定性,45℃保温50min后,剩余酶活为77%｡6.2.3金属离子对酶活的影响在溶菌酶中加入各种金属离子并保持离子浓度为0.01mol/L,置于20℃下,保温30min同时以不加金属离子的酶液作为对照,测定溶菌酶活性,可知,Ag+､Na+对溶菌酶具有一定的激活作用,Mn2+和Ca2+对溶菌酶略有抑制作用,其他一些金属离子如Ba2+､Fe3+､K+等对溶菌酶活性没有显著影响,说明溶菌酶与大部分金属离子都有良好的配伍性能｡6.2.4酶对细菌的水解作用用常规方法培养的革兰氏阴性菌和阳性菌,验证纯化的溶菌酶对其溶解作用｡结果表明,该酶对常见革兰氏阴性菌和阳性菌细胞壁均有溶解作用｡｡瓶皿左侧牛津杯中放入磷酸盐缓冲溶液作为对照,右侧牛津杯中为经纯化的溶菌酶酶液｡结语与展望蛋清溶菌酶最适作用温度为50℃,在室温下活性较低,所得溶菌酶最适作用温度为35℃,是一种低温酶,由于低温酶的低温催化能力,生产应用过程中无需加热和冷却,可以降低成本节约能源且不会影响产品的品质等,为其应用提供了许多优势｡蛋清溶菌酶仅对革兰氏阳性菌有作用｡本研究的溶菌酶溶菌谱广泛,对多种蛋清溶菌酶不能直接作用的微生物如大肠杆菌､金黄色葡萄球菌(蛋清溶菌酶需添加EDTA等试剂或其他酶辅助才能对大肠杆菌､金黄色葡萄球菌等有一定的溶菌作用[5]等都有溶菌作用｡对多种致病菌也有较强的溶菌作用,而且该溶菌酶在45℃以下和pH4.0-8.0都有较好的稳定性｡受金属离子影响较小,在医药和食品工业中具有独特的发展前景｡同时也是一种具有免疫和杀菌功能的效应分子[13]｡可选择性地分解微生物细胞壁的同时不破坏其他组织。且本身无毒无害｡因而它是一种安全性能很好的防腐剂杀菌剂｡可广泛应用于饲料加工、食品防腐、日用化工等行业｡应用生物技术手段生产工程菌溶菌酶成为当今的发展趋势，此方法可以