电喷雾质谱在非共价蛋白复合物研究中的应用

电喷雾质谱在非共价蛋白复合物研究中的应用1.前言质谱作为一种分析方法，长期以来一直用于小分子化合物的结构分析。直到80年代末电喷雾电离质谱（electrosprayionizationmassspectrometry,ESI-MS）和基体辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrixassistedlaserdesorptionionizationtimeofflightmassspectrometry,MALDI-TOF-MS）两种“软电离（softionization）”质谱的出现，才将质谱的分析范围扩大到生物大分子的结构分析。在生物界，生物分子的非共价特殊作用是分子识别的基础。因此，非共价复合物的检验在生物学上是一个重要的研究课题。虽然MALDI-TOF的较高灵敏度和Mr表征范围对于测定生物大分子物质优于ESI质谱，但是它在检测非共价复合物的应用上却受到供试品制备条件的限制[1]刘益华，徐俊福.基质辅助激光解吸飞行时间质谱在生物大分子中的应用.中国生化药物杂志.2004，25(3)：192-193。而ESI-MS对蛋白质复合物的研究在样品用量少、快速的情况下可得到可靠的数据和较多的信息。由于其具有灵敏度高、快速和质量精确度高的优点，复合物的化学计量比能够很容易地推导出。通过改变源的锥孔（cone）电压、改变溶液的pH值和进样毛细管温度，可以比较不同化合物与蛋白质的亲合力的大小[2]ParmanikBN,BartnerPL,MirzaUA,etal.Electrosprayionizationmassspectrometryforthestudyofnon-covalentcomplexes:anemergingtechnology[J].JMassSpectrom,1998,33(10):911-920。对非共价键复合物进行部分酶解或完全酶解，还可以确定小分子与蛋白质的结合位点[3]MillarAL,NicholasAC,JacksonNAC,etal.Rapidanalysisofepitope-paratopeinteractionsbetweenHIV-1anda17-amino-acidneutralizingmicroantibodybyelectrosprayionizationmassspectrometry[J].EurJBiochem,1998,258(1):164-169.。可见，ESI-MS可广泛用于研究蛋白质非共价键复合物。到目前为止，用ESI-MS观察到的不同的非共价键复合物包括蛋白质-蛋白质［4］OgorzaleklooRR,GoodlettDR,SmithRD,etal.ObservationofanoncovalentribonucleaseS-proteinS-peptidecomplexbyelectrosprayionizationmassspectrometry[J],JAMChemSoc,1993,115(10):4391-4392，蛋白质-配体［5］RobinsonCV,ChungEW,KragelendBB,etal.Probingthenatureofnoncovalentinteractionbymassspectrometry.Astudyofprotein-CoAligandbindingandassembly[J].JAmChemSoc,1996,118(36):8646-8653，蛋白质-寡核苷酸［6］Light-WahlKJ,SpringerDL,WingerBE,etal.Observationofasmalloligonucleotideduplexbyelectrosprayionizationmassspectrometry[J].JAmChemSoc,1993,115(2):803-804.和蛋白质-双链DNA［7］ChengXH,MorinPE,HarmsAC,etal.Massspectrometrycharacterizationofsequence-specificcomplexesofDNAandtranscriptionfactorPU.1DNAbindingdomain[J].Analbiochem,1996,239(1):35-40.及蛋白质-金属离子等［8］HuP,LooJA.Gas-phasecoordinationpropertiesofZn2+,Cu2+,Ni2+,andCo2+withhistidine-containingpeptides[J].JAMChemSoc,1995,117(45):11314-11319.。2.电喷雾质谱（ESI-MS）的基本原理及特点其原理是[9,10]岳贵花，许崇峰，卞利萍等.电喷雾质谱在非共价蛋白复合物研究中的应用.分析化学学报,2000,16(6):495-502.王红霞，杨松成.蛋白质非共价复合物的电喷雾质谱研究进展.药学学报,2001,36(4):315-320.:在高压电场下，少量的液体在雾化气的作用下形成溶剂化离子飞向电极，在这一过程中，受外界条件作用（如逆向干燥气流），逐渐脱溶剂化以致最终溶质离子从该溶剂化离子中解吸出来形成带多电荷分子离子进入质谱。电喷雾电离的特点是蛋白质等生物分子能产生多电荷离子，使质荷比降低到多数质谱仪都可以检测的范围，因而大大扩大了分子量的分析范围。分析物离子的真实分子量可以根据质荷比及所带电荷数计算，一般由计算机软件完成。电喷雾质谱可充许有少量的盐和缓冲液，但盐和缓冲液的存在会使仪器的灵敏度降低。电喷雾质谱的优点是可以方便地与多种分离技术联用，如液质联用和毛细管电泳－质谱联用等。3．喷雾质谱（ESI-MS）在蛋白质非共价键复合物研究的应用自1991年Ganem[11]GanemB,LIYT,HenionJD.Detctionnoncovalentreceptor-ligandcomplexesbymassspectrometry[J].JAmChemSoc,1991,113(16):6249-6296.等最早应用电喷雾质谱研究细胞浆中受体蛋白FKBP12及其配体FK506和rapamycin的非共价键复合物以来，该技术被越来越多的学者所应用。有关蛋白质－配体－以及组成蛋白质的各亚基间的非共价相互作用的文献报道很多，Joseph[12]JosephALoo.MassSpectrom.Review[J],1997,16:1.列出了近年来ESIMS在这一领域的研究进展。3.1蛋白质－蛋白质相互作用很多蛋白质在体内实验中相互作用很强，而相同蛋白质寡聚体或其他形成功能蛋白复合体相互作用很弱。ESI-MS可能可以通过质量的测定对蛋白质－蛋白质复合体的结构供应直接、明确的信息。与其他光谱技术相比，这种技术有很多优势，比如，测定余因子依赖蛋白质-蛋白质相互作用[84]。4-草酸丁烯酸酯异构体酶四级结构是第一次采用ESI-MS进行分析的寡聚蛋白[86]。根据分子筛色谱和超速离心，认为4-草酸丁烯酸酯异构体酶为五倍体[87]。X－射线衍射和质谱明确显示此蛋白质为一个41kDa的六倍体(86,88)。另一方面，四个单点突变4-草酸丁烯酸酯异构体酶只能形成单体蛋白质离子。这些数据说明自然蛋白具有寡聚行为，残基对保持六倍体结构有重要作用。在Standing等研究的基础上，其他研究小组也开始用ESI-MS分析已知和未知寡聚蛋白质复合体的化学计量式。在proteasome催化蛋白（89,90），chaperonecomplexGroEL[91]，和各种血色素[92-96]的研究中均得到有趣的结果。ESI-MS实验证明GroEL由两个七倍体环组成，并非共价结合14亚单元，总分子质量为800kDa[91]。GroEL在拥有co-chaperoneGroES的前提下才具有活性。进一步用MS研究GroES可变部分与模型底物helixD的相互作用[97]。结合荧光交联实验得到甚至在GroEL四倍体上也有GroES及底物蛋白明显，至少式部分结合的位点。根据MS研究，在大多数哺乳动物系统中血色素以分子量约为60kDa的四倍体存在，在低浓度下则很可能以二倍体存在。MS广泛用于研究血色素的结构。比如，镰刀红血球患者组织血液中的血色素S和胎儿血色素[98]。此研究总结了镰刀红血球病不均匀血色素混合物和其他四聚体的定量测定。所以，血红素亚基的非共价结合可用ESI-MS进行研究。质谱显示患者和胎儿血液均含有包含α2β2、α2γβ两种杂交体的完整血红素四倍体。根据不均匀血色素杂和物质量的测定，发现在患者血液中有一种平均质量为64.6kDa独特的四倍体标记蛋白。另一个优秀的研究显示MS可用于甲状腺传递系统寡聚蛋白的分析[99]。四倍体人类蛋白质reansthyretin通过与维生素A结合蛋白非共价结合传递荷尔蒙甲状腺素。Transthyretin被认为淀粉纤维的组成成分，并与一些疾病如Alzheimer’s，二型糖尿病和遗传性海绵状组织脑病有关。在正常情况下，transthyretin运输甲状腺素和维生素A，但是天然型展开和单点突变分别导致老年系统淀粉样变性病和家族淀粉质神经病。Transthyretin四倍体的分裂被认为是形成淀粉状纤维的第一步[100]。McCammon等用MS试验了18种这一过程的抑制剂(99)。测定了这些配体结合，稳定四倍体结构，与transthyretin复合体相互作用及与自然配体甲状腺素竞争的能力。通过对含有六个蛋白质亚基，两个维生素A分子和两个合成配体（四个transthyretin和两个维生素A结合蛋白）的多面十组分复合物的研究发现配体的加入不会抑制transthyretin与维生素A的结合。甲状腺素与作为探针的人工合成配体的作用特点则不一样。研究积极、消极与无作用机理；并证明人工配基对甲状腺素的结合产生消极影响。Loo等[]对ADH(AlcoholDehydrogenase)锌金属酶在乙醛、乙醇互变中的作用进行了研究，表明酵母及哺乳动物的ADHs都是均质的，在这个过程中，仅有25％的残基参与互变。在ESIMS分析蛋白质亚基结构过程中，溶液的pH及离子源的条件都很重要，在不同pH值下，蛋白质以不同数目的亚基聚集体存在。这对我们研究蛋白质性质具有重要意义。Standing等[]FitzgerraldMC,ChermushevishI,StandingKG,etal.Acad.Sci.USA[J],1996,93:6851.采用ESI-TOF-MS对4OT酶的低聚结构进行分析、测试，结果表明在溶液中其以六聚体存在，这和以往的X-Ray衍射结果一致。对SilurusAsotusRoeLectin(SAL)的ESIMS测定表明SAL的单体分子量为31750Da，而沉淀平衡法测定的分子量为95200Da。由此可以说明该蛋白质在溶液中以三聚体的形式存在。经基质辅助激光解吸飞行时间质谱测定验证了这一推断[]MurayamaK,TakaH,KagaN,etal.Anal.Biochemistry[J],1997,247:319.。Lafitte对钙调节蛋白在溶液中及变性条件下的蛋白质聚合体的研究与超离心测定结果一致[36]LafitteD,HeckAJR,HillTJ,etal.Eur.J.Biochem[J].,1999,261(1):337.3.2蛋白质和配体MS用于配体-蛋白质非共价作用的研究最初关注于完整亚铁血红素-肌血球素化合物[40]及完整复合FK结合蛋白（FLBP）[61]，后者为免疫抑制结合蛋白，可与免疫抑制剂FK506、rapamycin结合。非共价ESI-MS可以测定蛋白质-配体化合物的分子质量，所以它可以精确的区分结合在同一位点上的两个接近的相关配体。Ras蛋白结合GDP和GTP的研究有力的证明了这一点[73,74]。ras蛋白为细胞生长调整蛋白；结合GDP后活性丧失。因此，研究细胞生长过程对于区分GDP-ras蛋白与GTP-ras蛋白非常重要。根据分子质量的