沙棘果粉体外抗氧化研究

沙棘果粉体外抗氧化活性的研究马宁安耿春峰何茂军鲁平原（青海圣烽生物技术开发有限公司，青海西宁810016）摘要：采用不同方法测定沙棘果粉的抗氧化能力活性。实验条件下，沙棘果粉对DPPH自由基、超氧阴离子O2-、羟基自由基（·OH）、过氧化氢H2O2有较强的清除或抑制作用，且显示较好的量效关系。所以沙棘果粉有效成分具有较好的抗氧化作用。关键词：沙棘果粉；抗氧化；FRAP还原力；DPPH自由基；超氧阴离子；羟基自由基Studyofantioxidantactivityinsea-buckthornpowder（QinghaiShengfengbiotechnologydevelopmentco.,LTD，Xining，810016）Adoptingdifferentdeterminationmethods,theactivityofantioxidantcapacityofseabuckthornfruitpowderwasstudied.Underexperimentalconditions,sea-buckthornfruitpowderhasantioxidantcapacitytoDPPH,superoxideanionfreeradicalO2-,hydroxylradicals(•OH),hydrogenperoxideH2O2,andshowsgoodconcentrationrelationshipwithactivityofantioxidantcapacity.Resultsshowthatsea-buckthornfruitpowderhasgoodanti-oxidationactive.氧在生物体内通过单电子还原产生化学性质活泼的物质称为活性氧，包括超氧阴离子自由基、过氧化氢、羟基自由基等，它们可以与多元不饱和脂肪酸作用，造成脂质过氧化，从而诱发多种慢性疾病。抗氧化剂能有效清除自由基，延缓衰老和预防疾病。目前人们把抗氧化研究重点转向了天然、高效的天然植物提取物上，因此抗氧化活性评价方法对天然抗氧化剂的研究开发至关重要。沙棘，是胡颓子科植物沙棘(HippophaerhamnoidesL.)的成熟果实，又名沙枣、醋柳、黑刺。沙棘果中富含丰富的维生素、黄酮、酸酚、超氧化物歧化酶及ω-6多不饱和脂肪酸等营养成分和活性物质。现代医学研究证实，沙棘果具有抗衰老、清除自由基、抗辐射、提高免疫力、抗肿瘤等作用。通过喷雾干燥技术加工的沙棘果粉中含有维生素、黄酮、多糖、儿茶素等大量天然抗氧化活性成分，这些活性物质能与铅发生络合作用形成低毒或无毒络合物排出体外，对骨和肝组织有明显促排铅作用，能抗氧化和消除细胞膜上自由基，可以减少机体的氧化损伤，是天然的抗氧化剂。本试验以沙棘果粉为原料，测定其主要功效成分的含量并以化学测定方法评价沙棘果粉抗氧化活性评价体系，从FRAP（FerricreducingantioxidantpotentialAssay）总的抗氧化能力、清除DPPH自由基、清除O2-、抑制·OH等研究沙棘果粉的抗氧化效果，为沙棘果粉活性成分的综合利用提供依据。１材料与方法1.1试验材料1.1.1试验原料沙棘粉1.1.2试验试剂DPPH（1，1－二苯基－２－三硝基苯肼）、没食子酸丙酯（PG）、硫酸亚铁、30%过氧化氢、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、三氯乙酸、三氯化铁、铁氰化钾、盐酸、邻苯三酚、水杨酸、无水乙醇等1.1.3试验仪器分光光度计，PHS-25数显pH计，TDD5M型低速离心机。1.2试验方法1.2.1活性成分提取称取2.00ｇ沙棘果粉→蒸馏水浸泡30min（料液比1:16（m/v））→超声提取30min，室温提取2次→4000r/min离心5min→合并上清液→蒸馏水补重→低温避光，待用。1.2.2总抗氧化活性的测定—磷钼络合物法配制浓度分别为1、2、3、4、5mg/mL的样品溶液、PG溶液。在10mL比色管中，分别加入4.0mL磷钼试剂液、0.4mL样品液，95℃水浴中恒温90min，用紫外可见分光光度计在695nm波长下测吸光度A。所有测定平行进行3次，取平均值。1.2.3沙棘粉乙醇提取物还原力测定取不同浓度乙醇提取液2.5ｍＬ，其中加入pH为6.6、浓度为0.2mol/L的磷酸缓冲液2.5mL、１％的铁氰化钾溶液2.5mL，混匀后在50℃水浴加热20min，取出迅速冷却至室温后添加10％三氯乙酸2.5mL，以4000ｒ/min离心5min，吸取上清液5.0ｍＬ滴加1.0mL0.1％三氯化铁、4.0mL蒸馏水，振荡混匀，15min后于700nm测其吸光度值，重复试验3次。1.2.4对羟自由基的清除率测定1.2.4.1水杨酸法鉴于Fe２＋氧化H２O２产生的·OH氧化水杨酸生成的有色体系在510nm处有最大吸收，当加入清除·OH的物质时，会与水杨酸竞争·OH，减少有色物质生成，降低吸光度值。利用此原理，本试验操作为：吸取不同浓度乙醇提取液2.0mL，其中加9.0mmol/L的FeSO４2.0mL、9.0mmol/L水杨酸－乙醇液2.0mL、8.8mmol/L的H２O２2.0mL、蒸馏水2.0mL，37℃水浴30min后在510nm波长测吸光度值Ａｘ；用蒸馏水代替H２O２，得本底吸收值Ａｘ0，蒸馏水代替乙醇提取液，得空白值Ａ0；该试验以蒸馏水做参比，重复试验３次。羟自由基清除率计算公式：清除率（％）＝[Ａ0－（Ａｘ－Ａｘ0）]/Ａ0×100％1.2.4.2结晶紫法结晶紫分光光度法测·OH基本原理是：H2O2和Fe2+发生Fenton反应产生·OH。·OH容易进攻高电子云密度点，会与结晶紫中具有高电子云密度的C=C基团发生亲电加成反应，而使结晶紫褪色。通过测定结晶紫吸光度值的变化可间接测定出·OH的生成量。由样品储备液配制浓度为1mg/mL的样品溶液。在10mL比色管中分别加入0.3mL结晶紫、1.2mLFeSO4溶液和0.6mLH2O2溶液。用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液(pH4.0)定容到10mL并摇匀，放置30min后，在580nm处测其吸光度Ab(不加H2O2时580nm处的吸光度为A0)。则羟自由基的产生量可以用ΔA=Ao-Ab来表征。表观抗羟自由基氧化率的测定：在上体系中加H2O2之前加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL的样品溶液，测定其吸光度As，则表观抗羟自由基氧化率S可以根据下述公式计算。S(%)=(AS－Ab)/(A0－Ab)×1001.2.5对超氧阴离子的清除率测定。本试验采用邻苯三酚自氧化法：吸取pＨ8.34、浓度为50mmol/L的Tris-HCL溶液4.5mL，不同浓度乙醇提取液1.0mL，混匀，37℃水浴10min，然后分别加入0.5mL6mmol/L邻苯三酚溶液反应5min，最后加入浓度为0.1mol/L盐酸溶液1.0mL终止反应．经波长扫描，试液在326nm波长处有最大吸收，测得其吸光度值Ａｘ；用重蒸水代替乙醇提取液，得空白值Ａ０；用重蒸水代替邻苯三酚溶液得本底吸收值Ａｘ０；重复试验３次。超氧阴离子清除率计算公式：清除率（％）＝[Ａ０－（Ａｘ－Ａｘ０）]/Ａ０×１００％1.2.6对ＤＰＰＨ自由基的清除率测定ＤＰＰＨ是一种稳定的人工合成自由基，具有典型紫色，在517ｎｍ处有最大吸收，当它与提供１个电子的自由基清除剂作用时生成无色产物，紫色变浅。试验操作过程如下：吸取浓度为0.1mg/mLＤＰＰＨ储备液4.0mL，不同质量浓度乙醇提取液1.0mL混匀，于室温避光显色30min，在517nm处测得吸光度值Ａｉ；用50％的乙醇代替提取液，测得吸光度值Ａ０；吸取4.0mL乙醇提取液，50％乙醇1.0mL，测得吸光度值Ａｊ；重复试验３次。ＤＰＰＨ自由基清除率计算公式：清除率（％）＝[Ａ０－（Ａｉ－Ａｊ）]/Ａ０×１００％1.2.7过氧化体系中抗氧化活性(AOA)的测定配制浓度分别为1、2、3、4、5mg/mL的样品溶液、PG溶液。选用1:25的卵黄悬液并吸取0.2mL，加入样品液0.6mL，加入FeSO4溶液，用PB补充至2.0mL，37℃培养12h，取出后加三氯乙酸(TCA)，静置离心后吸取2.0mL上清液加入TBA(硫代巴比妥酸)，加塞，放入沸水浴中15min，冷却后，于532nm处比色测定吸光值(A)，对照管除不加提取液外，其它试剂同前，所测吸光值为A0，空白管调零，样品及PG对卵黄脂蛋白脂质过氧化的抑制率（AOA）可以根据下述公式计算。AOA(%)=(AO—A)/A0×1002.结果讨论与分析2.1总抗氧化活性的测定沙棘果粉总抗氧化活性测定结果见图1。样品水溶液的抗氧化活性大于PE溶液的抗氧化活性（p﹤0.05），样品乙醇溶液的抗氧化活性大于PE溶液的抗氧化活性（p﹤0.01）。由样品在水溶液中的抗氧化性优于在乙醇溶液中（p﹤0.05），样品抗氧化能力随着样品浓度的增加而增强。00.020.040.060.080.10.120.140.160.1812345浓度（mg/mL)吸光值（ABS)样品乙醇溶液PG溶液样品水溶液图1沙棘总抗氧化活性测定结果2.2还原力的测定沙棘粉还原力的测定结果见下图，由图可见，沙棘粉的还原力随着浓度的增加还原力增加。00.050.10.150.20.250.312345浓度（mg/mL)吸光值（ABS)图2沙棘粉还原力测定结果2.3对羟自由基的清除率测定2.3.1水杨酸法采用水杨酸法测定沙棘粉自由基清除率的结果见图3,沙棘果粉对羟基自由基具有较强的清除作用，浓度在1mg/mL~5mg/mL浓度范围内，清除率从15.43%增加到59.29%，呈现浓度依赖性。01020304050607012345浓度（mg/mL)清除率（%）图3水杨酸法测定沙棘粉自由基清除率的结果2.3.2结晶紫法采用结晶紫法测定的沙棘粉自由基清除结果见图4。结果表明，沙棘果粉浓度在0.05mg/L时，清除率最大为27.10%。2021222324252627280.010.020.030.040.05浓度（mg/mL)）清除率（%）图4结晶紫法测定的沙棘粉自由基清除结果2.4对超氧阴离子的清除率测定沙棘粉清除超氧阴离子的试验结果见图5，由图5可见，沙棘果粉对超氧阴离子具有较强的清除作用，在1mg/mL~5mg/mL浓度范围内，清除率从13.91%增加到70.43%，呈现浓度依赖性。0102030405060708012345浓度mg/mL清除率（%）图5沙棘粉清除超氧阴离子的试验结果2.5对DPPH自由基的清除率测定沙棘粉对DPPH自由基清除率的试验结果见图6，由图6可见沙棘果粉对DPPH有较强的清除作用，在浓度3mg/mL时清除率最高为69.95%，随后随浓度增加，清除率没有明显的增加趋势。0102030405060708012345浓度（mg\mL)清除率（%）图6沙棘粉清DPPH自由基的试验结果2.6过氧化体系中抗氧化活性的测定沙棘粉在过氧化体系中的抗氧化活性测定结果见图7，由图7可见，沙棘粉对对卵黄脂蛋白脂质过氧化物的抑制率可达到43%，随浓度的增加，抑制率没有明显改变。0510152025303540455012345浓度(mg/mL)抑制率（%）图7沙棘粉对卵黄脂蛋白脂质过氧化物的抑制率3.结论采用不同方法测定沙棘果粉的抗氧化能力活性。实验条件下，沙棘果粉对DPPH自由基、超氧阴离子O2-、羟基自由基（·OH）、过氧化氢H2O2有较强的清除或抑制作用，整体显示较好的量效关系。所以沙棘果粉有效成分具有较好的抗氧化作用。4.参考文献[1]朱利娜,强伟,史俊勇,索有瑞.唐古特白刺果粉抗氧化作用研究[J].食品工业科技;2006年05期[2]吴雪辉,黄永芳,高强,苏锦强,周薇,李昌宝.肉桂精油的抗氧化作用研究[J].食品科技;2007年04期[3]程超,李伟.几种植物水溶液性多糖的体外抗氧化作用[J].中药药理与临床,2004,20(2):22-23[4]章荣华,傅剑云,徐彩菊等.竹叶提取物抗氧化作用研究[J].中药药理与临床,2004,20(2):22-23