番茄内生产酸菌的分离与初步鉴定

番茄内生产酸菌的分离与初步鉴定张全钢张利平（河北大学生命科学学院，河北保定071002）摘要：植物内生菌广泛存在于各种植物中，在与宿主的协同进化过程中形成了两者的互惠共生关系。本研究从番茄样品中分离到内生产酸菌1株，编号：S11-1。经过形态观察及16SrDNA基因序列系统发育分析结果表明：菌株S11-1应归属于假单胞菌属(Pseudomonas)。关键词：内生菌；产酸菌；分离；鉴定中图分类号：Q815文献标识码：AIsolationandIdentificationofAcidogenicbacteriaEndophytesfromTomatoZhangQuangang,ZhangLiping,(HebeiUniversityofLifeSciences,Baoding,071002)Abstract:Plant,endophytesarefoundwidelyinallkindsofplantsstudied,therearecollaborationwiththeevolutionaryprocessandmutualsymbioticrelationshipbetweenplantsandendophytes.Inthisstudy,1AcidogenicbacteriaEndophytewasobtainedfromTomato.Accordingtotheresultsofmorphologicandpolyphasictaxonomy,thestrainS11-1belongstoPseudomonas.Keywords:Endophyte;acidogenicbacteria;isolation;identification内生菌（endophyte）指其在生活史的某一阶段或全部生活在宿主组织中，不引起宿主植物明显的病害症状，与宿主建立互惠共生关系的一类微生物[1]。研究发现内生菌能促进宿主生长，提高宿主抗逆性，增强宿主竞争力，其中内生产酸菌可用于新的活性物质的筛选。近年来，在医学、农业和生物学中对内生菌的研究和应用逐渐成为新的热点，并取得了许多进展[2][3]。1材料与方法1.1材料新鲜的番茄。1.2培养基分离培养基(％)：葡萄糖1、尿素0.1、KH2PO40.1、MgSO4·7H2O0.1、蛋白胨1、牛肉膏0.3、酵母膏0.3、CaCO30.7、琼脂2，pH6.8-7.0。斜面培养基(％)：葡萄糖1、蛋白胨1、KH2PO40.1、MgSO4·7H2O0.2、酵母膏0.5，酶解酪素0.3，琼脂2，pH6.7-7.0。液体培养基(％)：葡萄糖1、牛肉膏0.3、蛋白胨1、K2HPO40.1、MgSO4·7H2O0.2、酵母膏0.5，pH7.0。1.3分菌方法1.3.1供试样品的表面消毒和检验：用洗涤液洗净样品表面，流水冲净残留的洗涤液。再用70%乙醇浸泡2min，后用0.2%升汞浸泡10min，磁力搅拌下无菌水清洗10遍[4]。取最后一遍清洗的无菌水0.1mL涂布于分离培养基，每个处理重复3次，28℃下培养3-5d，据此验证此消毒方法是否能全部杀死供试材料表面微生物[5]。1.3.2番茄内生菌的分离和纯化：表面消毒处理后的样品，用磷酸盐缓冲液(蒸馏水1000mL,NaCl8g,KCl0.2g,KH2PO40.2g,Na2HPO41.0g,pH7.4)研磨，研磨液用四层无菌纱布过滤后取0.1mL涂布于分离培养基,作者简介：张全钢(1980-)，男(汉)，河北唐山人，河北大学硕士研究生，主要从事微生物发酵研究。电话：[phone]，E-mail：[e-mail]28℃下培养3-5d，挑取由于产酸而使CaCO3溶解形成透明而清晰的溶钙圈的菌落转接到斜面培养基上保存[6]。1.4菌株的初步鉴定菌体接种到液体培养基中，28℃摇床培养24h，6000r/min离心5分钟收集菌体，用CTAB法[7]提取基因组DNA。PCR扩增16SrDNA采用通用引物，Pf为5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，Pr为5′-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3′。扩增程序为：95℃预变性4min，进入循环：94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸1.5min，进行30个循环后，72℃后延伸10min。PCR扩增产物经电泳检测后送北京三博远志生物有限责任公司测序。将所测得16SrDNA序列在GenBank中通过BLAST进行比较，从GenBank中获得和试验菌株相近种属的16SrDNA序列构建系统发育树，以确定供试菌株的分类地位。采用Clustalw1.8软件进行多序列匹配排列，进化树的构建用PHYLIP软件包中的Neighbor-joining进行，进化距离根据PHYLIP软件包中的Kimura2参数模型来计算[8]。2结果2.1番茄内生菌的分离结果番茄表面消毒检验中未出现菌落，表明该消毒法可行，分离的是番茄内共生微生物。从番茄样品分离到能产生溶钙圈的产酸菌1株，编号S11-1。2.2菌株S11-1的初步鉴定2.2.1形态特征：菌落圆形白色，不透明，表面凸起有光泽，边缘整齐规则。菌落潮湿，挑起呈丝状。培养3天后为红色。菌体是直或微弯的短杆菌。好氧，革兰氏染色阴性。2.2.2菌株16SrDNA系统发育结果：菌株S11-1的16SrDNA核酸序列长为1453bp，将其与从GenBank等数据库中调出的相应菌属的标准菌株的16SrDNA序列进行比较，所构建的系统发育进化树见图1。图1根据菌株S11-1和假单胞菌属（Pseudomonas）部分相关菌株16SrDNA序列构建的系统发育树Fig.1Neighbour-joingtreebasedon16SrDNAsequencesshowingrelationshipbetweenstrainS11-1ofPseudomonas3讨论植物内生微生物的分离，首先要保证表面消毒彻底，消毒措施的力度(包括消毒剂的杀菌力、使用度、消毒时间等)越大，灭菌就越彻底，但是消毒对植物组织细胞都是有毒的，消毒能力越强对组细胞的损伤也就越重，从而改变植物内部的生态系统，影响随后的内生菌分离。这也许是本试验中分离菌数不多的原因之一，如何减少表面消毒剂的性，如采用一定浓度的次氯酸钠等，还须要进一步探究。从番茄样品中分离纯化出1株产酸菌S11-1，依据16SrDNA序列构建的系统发育树可知菌株S11-1与荧光假单胞菌（Pseudomonasfluorescens）的进化距离最近为99.3%，可以初步鉴定菌株S11-1属于假单胞菌属（Pseudomonas），为深入研究该菌的活性及对宿主所起的作用奠定了基础。[参考文献][1]KloepperJW,etal.Areviewofissuesrelatedtomeasuringcolonizationofplantrootsbybacteria[J].CanJMicrobiol,1992,38:1219-1232.[2]梁宇,高玉葆,陈世苹等.干旱胁迫下内生真菌感染对黑麦草实验种群光合、蒸腾和水分利用的影响[J].植物生态学报,2001,25(5):537-543.[3]陈世苹,高玉葆,梁宇等.水分胁迫下内生真菌感染对黑麦草叶内保护酶系统活性的影响[J].应用与环境生物学报,2002,7(4):346-354.[4]肖显华.植物材料表面消毒方法的改进[J].生物技术,1999(1):43-45.[5]宋子红.花生内生菌的种群及动态分析[J].植物保护学报,1999,26(4):309-341.[6]石岗,颜方贵.维生素C重要前体2，5-二酮基-D-葡萄糖酸发酵研究[J].食品与发酵工业，2002，28（5）:18-24.[7]林加涵,魏文玲,彭宣宪.现代生物学实验[M].北京:高等教育出版社,2001:100.[8]KIMURAM.ASimpleMethodforEstimatingEvolutionaryRatesofBaseSubstitutionsThroughComparativeStudiesofNucleotideSequences[J].JMolEvol,1980,16:111-120.