病生教研室学术讲座

病生教研室学术讲座题目：老年性痴呆与转基因动物模型讲述者一般情况：宋葆华，女，讲师，教研室副主任病生教研室2004年11月12日2实验动物(Animal)、设备(Equipment)、信息(Information)和试剂(Reagent)被称为生命科学研究中的四大要素。据统计，医学研究中有60%的研究是应用实验动物完成的，由此可见实验动物在医学研究中的重要性。在人体上的研究仅限于观察，随机性和任意性很大，样本量小，而且受到很多客观条件的制约，对疾病病因和自然转归很难观察到。从医学伦理学和法律角度，在未经严格的动物实验的检验和相关的法律和管理部门的审批，任何新的药物或医疗措施是不能在人体上进行的，因此动物实验是医学研究最常见的选择。实验动物在医学中的应用可分为两大类：用于正常生理研究用的生物医学模型和用于疾病或病理过程的疾病动物模型。一、动物实验有很多优点：1、能够进行在人体上无法进行的各种处理，在很大程度上能够取代或弥补人体实验的不足。2、对样本可以自由选择、分组或设计，从而可以最大量限度地抽提出实验效应的信息以便分析和处理。3、实验条件可以严格控制，从而保证实验的可靠性和精确性。4、研究的周期较短，可以人为控制，对疾病的发生、发展和转归可以进行全过程的研究。二、医学疾病动物模型的制备的原则1、人类和其它动物具有生物学的共同性。2、要具有相似性和可比性。3、一致性和重复性。克隆化和转基因技术为基因的一致性提供了有力的手段。4、确定性和可控制性。5、生物性状的特殊性。6、实用性和经济性。7、安全性和生态后果：在进行病毒等有害的研究中应充分考虑这一点，在转基因动物的研究中也应严格控制，以避免意想不到的后果。8、理和法律学问题。三、疾病动物模型分类1、按制备方法分类：人为诱发性模型和自发性模型。2、按实验持续的时间分类：急性实验和慢性实验。3、按研究的层次分类：亚细胞和分子水平、细胞培养、离体组织和器官灌注和整体水平。转基因动物模制备是在细胞水平上对基因的操作。小鼠具有易患多种与人相类似的疾病，遗传背景清楚，繁殖力强，个体小，费用低，因而被广泛应用于各种生物学研究中。四、转基因动物模型目的:1、转基因动物研究可以使人类更好地对付各种疾病。在对付遗传病的战斗中，最关键的武器是掌握科学知识。科学家要最终战胜各种遗传疾病，首先必须搞清楚每种病的致病机理。利用转基因动物可以为研究遗传疾病的基因治疗打开方便之门。2、转基因动物不仅可以用来摸索基因疗法的经验，而且还可能为因患病而导致某个器官功能衰退的病人提供健康的器官，如心、肝、肾等。例如，几年前，英国剑桥的几位科学家为一只猪胚胎导入了人的基因，因而培育出了世界上首例具有人的基因的转基因猪，在世界上引起强烈反响，许多报刊都以具有人类心脏的猪为题对这头名叫阿斯特丽德（Astrid）的猪进行了报道。目前，这种转基因猪已发展到数百头。科学家的目的是希望这种转基因猪能为人类提供健康的器官。现在，他们已在进行把转基因猪的器官移植到灵长目动物身上的试验，预计移入人体的试验将在本世纪末得以实施。如果这项计划能够成功的话，那么将解决人类备用器官的缺乏，使千百万名患者脱离死亡。遗传学研究的飞速进展使人相信，总有一3天，转基因动物会成为未来的器官工厂。3、研究转基因动物还有另外一个十分重要的目标，那就是培育具有更优良性状的转基因动物。4、培育抗病能力强的禽畜新品种是转基因动物研究的另一目标。5、转基因动物研究在其它一些领域也取得了新进展。转基因动物研究的目的是不仅要培育与我们人类生活息息相关的转基因动物，同时也要促进基础生物学研究的发展。基础科学是源，实用科学是流，只有基础科学发展了，实用科学才能得到发展，所谓源远才能流长。因此，以基础生物学研究为目的进行的转基因动物的研究万万不可忽视。五、转基因动物模型制作的程序：转基因动物的制作是一个复杂的专门技术，但各种转基因的制作的基本程序相似。转基因动物制作的简单程序如下：①靶基因的制备②重组靶基因显微注射小鼠受精卵。③转基因桑椹胚移植入假孕受体④转基因鼠的组织检测显微注射法这一方法外源DNA整合率高、容量大，DNA长到50kb仍然有效，实验周期缩短，因而应用较广泛，是制备TGM的一种常用方法。图23-2显微注射法制备转基因小鼠的程序六、利用转基因方法建立人类疾病动物模型和用其他方法相比具有许多优点。诸如遗传背景清楚，遗传物质改变简单，建立的模型更自然和更接近病人症状；建立过程操作简便，周期短，而且建立的转基因动物模型不需要特殊的饲养条件即可保持疾病症状，按照孟德尔规律代代相传，维持费相对较代等。4七、目前转基因动物模型仍存在一定的问题：譬如有时转基因动物模型缺乏典型的像病人那样的症状；外源基因插入宿主基因组而引起插入突变，破坏宿主基因组基因而产生异常，甚至导致转基因动物的不育和死亡；外源基因在宿主动物染色体上整合的拷贝数不等，单位拷贝的外源基因表达水平不均一，给外源基因的表达控制带来困难；症状严重的还易早死；外源基因在宿主染色体上的部分整合导致外源基因的不表达，不出现预期的严重的还易早死；外源基因在宿主染色体上的部分整合导致外源基因不表达，不出现预期的症状或与预期的结果不符合；有时还会出现整合的外源基因遗传丢失而导致转基因动物模型症状的不稳定遗传等。尽管人类疾病转基因动物模型仍然存在一些问题，但随着转基因技术的不断完善，理想的转基因动物模型必将明显增多。转基因动物作为一种新的研究工具与实验手段，在现代生理学、遗传学，药物学、生物化学与分子生物学等学科研究的配合下，必将更有助于人们找出早期诊断疾病的方法，寻找新的治疗途径与对策。总之，人类拥有的有关基因的知识越多，就越能更好地利用它们，更好地去解决人类所面临的像疾病之类的诸多问题二、老年性痴呆病（Alzheimerdisease,AD）动物模型研究进展AD是老年人的常见病和多发病，病因和发病机理目前尚未完全明了，故缺乏有效的治疗方法。但其病理学有一定的特征，以老年斑（SP）和神经原纤维缠结（NFT）及选择性的细胞丧失为其特点，AD转基因的动物模型近年来的进展非常迅速，各种AD转基因模型不断被报道。现有的模型大多数是将不同结构的App基因转移到受精卵，但真正理想的转基因模型尚不多见。1、APP转基因小鼠：Aβ作为APP的一个片段，与AD两大病理学特征SP和NFT的形成都有密切关系，现在多数研究者认为，APP基因异常代谢产生Aβ是AD发病过程中的关健环节。APP转基因小鼠常用来研究APP的加工和代谢过程，APP和Aβ在AD过程中可能的作用途径以及从整体上阐明APP或Aβ同认知缺损之间的关系或进行治疗药物的筛选。值得注意的是，在各种APP转基因小鼠中，Aβ沉积的分布区域与人类AD在很大程度上相似。2、TAU转基因小鼠：现在，数种神经退行性疾病（包括AD）被统称为“TAU病”，它们的共同特征之一是有由微管相关蛋白TAU组成的神经元丝状内含物。TAU在神经元的体数定位类似于在人类TAU病中观察到的缠绕形成的前期状态。3、抗神经生长因子转基因小鼠：神经生长因子（NGF）与年龄相关性神经元退行性疾病有关，老年抗NGF转基因小鼠可表现出年龄相关性神经元退行性病理变化，皮质及海马神经元出现SP，不溶性的过度磷酸化的TAU和NFT，还出现文广泛的皮质神经元丢失，基底前胆碱能损害和行为损害。4、多个基因共表达的转基因小鼠：目前AD患者脑中的淀粉样物和TAU病变之间的关系仍不清楚，多个基因共同表达的转基因小鼠似有助于该问题的阐明。这种双重转基因后代，可同时产生神经元纤维缠结和淀粉样斑块病变。更为显著的是，该模型边缘系统和神经纤维病变大幅度增加。转基因动物模型是以遗传基因学说为基础的，是研究AD的有效手段。β-淀粉样蛋白（Aβ）具有神经营养和神经毒性的双重作用，对一些未成熟的神经细胞有营养作用，而对那些已分化成熟的神经元则起毒性作用。Aβ的前体蛋白是APP，APP分布广泛，至少有四种不同的同质异构体。Aβ本身在低浓度时有神经体护性作用，但高浓度时则具有神经毒性。另一种理论认为，Aβ是一普遍存在的APP的正常代谢产物，在健康个体中无毒，但当这些结合到脑脊液中的蛋白清除机制失误时，毒性便产生。将APP基因或基因片段转入动物受精卵中，再植回子宫，发育即成为转基因动物模型。APOE是一种低密度脂蛋白，它在调节外周和中枢神经系统损伤后脂代谢过程中起重要作用，与家族性和散发性的AD密切相关，在大鼠脑内，在与突触可塑性相关的膜重建过程5中，APOE对胆固醇和磷脂的代谢及重新分布起关健性作用。主要有ε-2、3、4，三种异构体，主要在肝细胞、脑胶质细胞及小星形细胞中表达。在人类，ε4对散发性及家族性AD是一个重要的危险因素，两者密切相关，可能与突触重建过程中脂质的运输发生障碍有关。ε4对AD过程中胆碱能功能有直接的影响。也有人认为，在AD过程中APOE与TAU蛋白特异化相互作用改变了神经元TAU蛋白的代谢和磷酸化状态，从而调节神经元纤维缠结的形成速度。神经元纤维缠结的主要纤维成分是双螺旋状纤维丝，它由高度磷酸化的与微管相关的TAU蛋白形成。在AD形成过程中，TAU蛋白在许多位点高度磷酸化，与能再与微管结合，在细胞内重新分布，然后聚集成神经元纤维缠结。早老蛋白（PS）基因与家族性AD的发生密切相关，也可以建立PS的转基因小鼠模型。转基因动物可以在活体上研究某上特定致病基因的作用，是研究AD的独特而重要的模型，基于遗传背景，繁殖能力，操作难度和经济角度的考虑，目前的转基因动物多选小鼠。现有多种转基因小鼠可表达与AD有关的基因如APP、APP的C末端片段、TAU、PS-1和PS-2、APOE。转基因动物模型的评价：在众多AD研究的动物模型中，我们认为转基因动物模型有其特有的优势及广阔的发展空间，近年来，AD转基因动物模型发展非常迅速，各种报道层出不穷。该模型主要用于研究AD病理改变与外源性基因的关系及其分子机制，也可用来试验新的老年性痴呆治疗药物。转基因动物模型的优点是模似了AD的多种神经病理改变且目前进展迅速，但仍存在下列问题需要解决：1、非APP基因相关的因素使小鼠不能建立AD模型；2、与APP基因分子及结构相关的原因不能建立小鼠AD转基因模型；3、APP转基因表达的调节；4、调整APP序列是表达水平的重要条件；5、由于转基因随机整合到动物的基因组，外源性基因的进入可能会影响一些基因的表达与调控，扰乱了进化过程中形成的稳定、平衡、优化的内环境，因而转基因动物普遍表现为繁殖能力低，抗病能力差。6、尤为关健的是移植了一个外源性基因的转基因动物模型实际上应由一组基因控制的动物模型之间还有很大的差距，与AD相关的基因组的结构，功能及其片段的长度仍需进一步探讨。由于AD不是单基因控制的疾病，在转基因动物模型中，能否通过不同外来基因导入的转基因动物繁殖出更理想的转基因动物模型，是一条值得探索的途径。请看下面这则报道《MAYO诊所研究员繁殖出具有老年性痴呆病特征的小鼠》：杰克逊维尔，佛罗里达，7月31/波多黎各新闻专线/--在佛罗里达州杰克逊维尔的MAYO诊所研究员成功的繁殖出了大脑患有神经纤维缠结，具有人类老年性痴呆症病理特征的小鼠。这只小鼠模拟了人类神经纤维缠结的形成过程，为研究者希望攻克预防、治疗老年性痴呆和其他痴呆症提供了重要的基础。在DennisDickson博士的领导下，MichaelHutton哲学博士、JadaLewis哲学博士、MAYO诊所的一群神经生理学家、神经遗传学家和纽约AlbertEinstein大学医学院的同事6们通过基因工程繁殖出控制tau蛋白产生的基因突变后的小鼠。这种突变已为人们所知，能导致额颞性痴呆的遗传。自出生六个半月后，小鼠开始产生神经纤维缠结，即异常扭曲的tau蛋白链丛，表现出与患有痴呆症病人相似的症状。Hutton博士说这只小鼠能够帮助我们搞清斑块和缠结之间的关系。如果使用菌苗清除了小鼠大脑中的淀粉，我们能阻止缠结的形成吗？还是缠结太强劲，疫苗根本不能阻止它们？我们仍不明白什么因素影响了缠结的形成和最终导致神经元的死亡