白喉毒素类免疫毒素研究进展

白喉毒素类免疫毒素研究进展系别：医学系专业：生物技术（生物制药方向）姓名：王雅玉学号：201102004017摘要白喉毒素类免疫毒素是将天缺失然受体结合活性的白喉毒素片段或突变体与抗体或细胞因子偶联而得到的一类新型导向药物，它可特异性识别并结合靶细胞，通过发挥其ADP核糖基化活性而抑制细胞蛋白合成，引发细胞凋亡。由于白喉毒素类免疫毒素能高效，特异的杀伤特定靶细胞，而使其在肿瘤等疾病的药物开发中崭露头角。综述了基于白喉毒素的免疫毒素的研究现状与应用前景。关键词：白喉毒素免疫毒素研究进展高效、特异地杀灭肿瘤细胞一直是肿瘤治疗的难题。导向性治疗药物由于可特异性杀伤肿瘤细胞，具有副作用低、高效的特点，因而成为近年来肿瘤治疗研究的热点。导向药物的概念最早由德国药物化学家PaulErhlich提出，它主要由两部分组成：能识别并结合肿瘤细胞表面标志物的导向部分和在导向部分的引导下进入细胞并发挥细胞毒作用的效应部分（图1）。导向部分为抗体或细胞因子等，效应部分为放、化疗药物或生物毒素。免疫毒素是将生物毒素与抗体或细胞因子连接起来的导向药物，又称作生物导弹或毒素。常用的生物毒素包括细菌来源的白喉毒素（diphtheriatoxin.DT）假单细胞杆菌外毒素（pseudomonasextoxin.PE），植物来源的蓖麻毒素（ricin）、相思豆毒素（abrin）和其他来源的核酶（ribonuelease）、磷磷脂酶C（phospholipaseC）、补体等。基于白喉毒素的免疫毒素是近十年来的研究热点。其中ONTAK（DAB389-Ⅱ-2）在1999年被美国FDA批准上市，用于承认皮肤T细胞淋巴瘤的治疗，这使免疫毒素的研究者深受鼓舞。本文主要综述基于白喉毒素的免疫毒素的研究现状与应用前景。1白喉毒素类免疫毒素1.1免疫毒素中的白喉毒素利用DT分子的3个功能区(A、B、R)在空间上相互独立的特点区发挥酶活性,B区具有细胞结合活性,同时有介导A区内吞转移的作用。通过基因重组,将R区突变失活或删除,用能特异性识别肿瘤细胞表面分子的结构(如细胞因子、单克隆抗体等)取代,此种融合蛋白又称免疫毒素,它对正常细胞不产生毒性,可通过与肿瘤表面受体结合而特异性杀伤肿瘤细胞。此外,还可利用DT的高毒性,将编码DT的基因插入肿瘤细胞,并在肿瘤部位稳定表达,使肿瘤细胞死亡,达到肿瘤基因治疗的目的。目前常采用截断的DT(如DAB388、DAB389等)或将B区去除或点突变,可以制备一系列DT的衍生物或DT的突变体(如CRM9、CRM107)。因此,免疫毒素中的白喉毒素大多保留了DT的A区和B区,利用了酶活性和跨膜转运的功能。所以这类DT非常特异,对正常细胞低毒,由于靶细胞特异性结合的导向部分不同,从而赋予了免疫毒素的细胞特异性。1.2白喉毒素类免疫毒素的导向部分导向部分可分为两类,一类是抗体或抗体的一部分、突变体,另一类是细胞因子或其他能与细胞表面特异结合的分子。已报道的研究导向分子有:抗Tac抗体、IL-2、IL-4、EGF、VEGF等。1.2.1单链抗体Fv片段是指成对的VH和VL结构域,如果将VH和VL用一个小肽(Linker)连起来,即组成了单链抗体(scFv)[1]。分子质量较小且保留了原有单价Fab的抗原结合能力,有利于穿过血管组织定位于肿瘤。同时具有生物活性高、成分均一、特异性强等特点,很受免疫毒素研究者的欢迎。1.2.2嵌合抗体嵌合抗体是指用基因工程技术使同一抗体分子中含有不同种属来源抗体片段的抗体。目前主要是“鼠—人”类型,即由鼠抗体的Fab或F(ab′)2与人Ig的Fc段重组构成。嵌合抗体的C区是人源的,同时具有抗原结合能力及Fc的效应,可以根据所要求的抗体效应功能选择人重链各亚类的C区基因。通常选用IgG1的C区,因为其Fc能结合巨噬细胞、多形核白细胞等的Fc受体,从而介导ADCC和补体激活的杀伤效应,例如人—鼠IgG1嵌合抗体能介导针对肿瘤细胞的单核细胞和淋巴细胞抗体依赖的细胞介导的细胞毒性。1.2.3重构抗体将特异抗体的CDRs移植到另一个抗体的可变区框架上,这种仅拥有鼠源CDRs的人抗体分子几乎可以说是人源的,称人源化抗体。根据已知的人抗体序列,选取与供体鼠抗体框架区同源性最高的人抗体分子作为构建重构抗体的基础,VH和VL的框架区不必来源于同一抗体分子;另一种是根据已知的X光衍射结构选取人的框架区,再根据植入特异抗体CDRs的结构来修饰人供体的框架区。1.2.4人源抗体、抗体库、分泌人抗体的小鼠抗体库如果将人免疫球蛋白基因组替代小鼠的,并进行正常的B细胞发育,包括重排,那将得到有特异结合能力和各种效应的完整人单抗。将各种B细胞的轻、重链V基因分离出来组成轻、重链V基因库,通过随机配对组装入载体,从而组成巨大的抗体组合基因文库。但是体内抗体与抗原的结合力是在逐次免疫后提高的,即亲和力成熟现象[1]。3.白喉毒素免疫毒素的构造和效应3.1白喉毒素免疫毒素的连接方式免疫毒素的连接方式有两种,包括化学偶联法和基因工程融合法。以化学偶联法制备的是第1代免疫毒素,又被称作免疫偶联物;虽然单抗的导向性很好,但这类免疫毒素的制备复杂,易损失抗体的活性,而且免疫毒素的稳定性差,动物试验效果不好;以基因工程融合法制备的第2代免疫毒素,是根据分子生物学技术将导向与效应两部分的基因串联,在大肠杆菌等细胞中表达,得到免疫毒素蛋白。这类免疫毒素制备相对简单,蛋白稳定、均一,分子质量小、渗透性好。经FDA批准上市的ONTAK就是第2代免疫毒素的成功例子。近来的研究中出现一些新型的免疫毒素,其疗效有待观察。一种是以基因治疗的方式,将带有特异性表达启动子与DTA片段基因的表达载体导入体内,通过靶细胞内毒素的特异表达杀死细胞。另一种是建立分泌表达免疫毒素的T细胞系,将该细胞导入体内进行治疗。目前免疫毒素类药物多指蛋白质类药物,但未来可能会扩大包括上述免疫毒素基因治疗的核酸类药物和表达免疫毒素的特定淋巴细胞类药物等。3.2白喉毒素免疫毒素的抗癌效应白喉毒素A片段可使核蛋白体上的肽链EF-2失活,从而抑制蛋白质合成,则细胞变性坏死,应用这个特性可杀伤肿瘤细胞而发挥作用。白喉毒素抗肿瘤活性的研究取得了很大进展,而且在临床肿瘤治疗中也显示一定疗效。用纯化的白喉毒素给50例进行性实体瘤患者作静脉注射,治疗后,部分病例的肿瘤发生退变,其毒素的剂量根据病人对白喉的不同免疫状态而定。治疗中最突出的毒性作用是暂时性周围神经病变、发热及伴有过敏反应。白喉毒素类免疫毒素与细胞凋亡也有密切的关系。携带反义人CAS基因的质粒,可抑制肿瘤坏死基因(TNF)和白喉毒素类免疫毒素促凋亡作用,提示CAS基因在凋亡过程可能起一定作用,DT/GM-CSF可提高神经鞘磷脂酶活性,促进神经鞘磷脂水解和神经酰胺生成,可使AML细胞U937株发生凋亡[2]。目前白喉毒素抗肿瘤活性的研究已经取得了很大进展。DT/IL-2蛋白因能特异性杀伤表达IL-2受体的细胞而被广泛用于上述肿瘤的治疗研究。其中DT389/IL-2已通过美国FDA批准用于CTCL的临床治疗。对HD、NML等淋巴瘤的治疗也已进入Ⅰ期临床试验。此外,DT/IL-2在其他一些难治性疾病(如HIV感染、银屑病、类风湿关节炎等)治疗上也取得了一定进展。而且在临床肿瘤治疗中也显示一定疗效,DAB389/IL-2迅速又显著的抗瘤活性提示其可直接抑制肿瘤细胞的蛋白质合成而非免疫机制。重组DT390-IL-13蛋白可特异性抑制GBM肿瘤U373株的增殖,并在裸鼠移植入GBM试验中亦得到证实。重组DT388/GM-CSF结合物,由于GMCSF受体在许多实体瘤和白血病细胞上高表达,因此DT388/GM-CSF结合物可杀伤胃癌、结肠癌细胞;大量研究结果表明,对AML细胞有较强的特异性抑制作用,但对正常骨髓细胞无明显毒性,动物试验结果表明可抑制裸鼠体内移植性AML细胞的生长,对CD+87AML母细胞的增殖和克隆形成均有特异性毒性作用,其毒性较DT/GM-CSF约高10倍,但对正常骨髓造血细胞无明显毒性作用[1]。将重组毒素VEGF、VPF165拼接到一个剪切过的白喉毒素分子(DT385)上,该结合物对VEGF、VPF受体阳性细胞具有选择性毒性作用。VEGF、VPF两个主要受体在肿瘤血管内皮细胞中高表达,所以VEGF可将毒素肽链传递到增殖的肿瘤血管内皮上,起靶向治疗作用。用DT389/EGF重组蛋白对过度表达EGF受体的胶质细胞瘤(GBM)有较强的选择毒性作用[3]。4白喉毒素免疫毒素的开发应用目前上市的免疫毒素只有白喉毒素类的ON-TAK(DAB389/IL-2),针对各种细胞表面特征分子的相关免疫毒素的研究报道很多,在临床试验的Ⅰ、Ⅱ期显示了对化疗耐药性和难治愈癌症的明显抗癌活性,已进入Ⅰ、Ⅱ期临床试验阶段或已上市的DT类免疫毒素。见表1表1进入临床试验或已上市的DT类免疫毒素免疫毒素治疗疾病研究阶段DT388/GM-CSF急性髓系白血病Ⅰ期临床DT390/FNl8sFV可诱导器官移植耐受性细胞试验DAB389/SP慢性疼痛动物试验DT390/VEGF165卡波济氏肉瘤细胞试验DAB389/EGF乳腺癌Ⅰ/Ⅱ期临床HN66000神经胶质瘤Ⅰ期临床DAB389/CD4HIV感染的细胞Ⅲ期临床DAB389/IL-7恶性血管瘤Ⅲ期临床DAB389/IL-4卡波济氏肉瘤细胞Ⅲ期临床DAB390/IL-6骨髓瘤细胞Ⅲ期临床DAB389/TGF-α上皮癌Ⅲ期临床5白喉毒素类免疫毒素研制与应用中的问题影响ＤＴ类免疫毒素的因素是多种多样的，分析各种可能的因素，才能在研制新一代免疫毒素中进行改进以提高药物效果，减少毒副作用。5.1靶向分子的特异性和异质性肿瘤细胞特异性抗原的存在尚未证实，而肿瘤相关抗原或细胞分化抗原与正常组织细胞存在不同程度的交叉反应性。目前使用的靶向分子多是在恶性细胞上以超过正常组织细胞千百倍地过量表达。虽然未见报道，免疫毒素识别正常细胞上的靶向分子、进而造成特定组织损伤的可能性仍无法排除。此外，DT类免疫毒素杀灭细胞的两个重要步骤是与靶向分子的识别与结合[4]。如有些难治愈肿瘤细胞缺乏靶向分子或内吞功能有缺陷。因而无法将其杀死。采用针对肿瘤细胞上不同靶向分子的多种免疫毒素进行联合治疗，也许可以解决缺乏靶向分子的问题。5.2毒性及机制DT类免疫毒素的毒性引起的轻微症状包括发热、寒战、呕吐、肌痛、心搏徐缓、体重增加低钙血症低白蛋白血症、低纤维蛋白原血症、高钾血症等。较严重的症状包括常见的血管渗漏综合征系统性炎症反应综合征、脑损伤、、肝肾轻微或严重损伤，转氨酶升高等。免疫毒素引起毒性的直接原因可能是细胞非特异吸收免疫毒素。间接原因可能是由于正常淋巴细胞上的靶分子被识别。例如：肝枯否式细胞上有GMCSFR，或巨噬细胞非特异性识别地吞入毒素；随后炎症因子被释放，导致周围组织继发炎症反应。5.3药物代谢与渗透性白喉毒素类免疫毒素在体内的浓度和维持时间与其活性的发挥是相关的。如果阐明白喉毒素类免疫毒素的代谢过程，则可提高药效和安全性。一般来说，部分60KD的小分子免疫毒素经肝脏及网状内皮系统代谢。半衰期与分子量相关，小分子免疫毒素半衰期长。渗透性是影响药效的另一个重要因素，小分子的渗透性好于大分子。分子量较大的免疫毒素渗透性差，难以穿透实体瘤杀伤内部的肿瘤细胞，治疗效果不好。但渗透性对腔内肿瘤、血液肿瘤及转移的小肿瘤灶等治疗效果的影响较小。5.4单克隆抗体的人缘化与小型化单克隆抗体与白喉毒素的偶联物在动物试验中目前已取得较好的效果，但抗体的异源性是个重要的问题。目前应用的单克隆抗体多为鼠源性抗体，用于人体时将产生抗鼠源单抗的抗体，可能会限制其体内应用，影响其使用次数和疗效。运用基因工程的方法将鼠源单抗的骨架区进行人缘化和小型化。如设计单链抗体，可减少免疫源性和增强渗透的效果。通过改变抗体的类型或亚型，可增强体内治疗的效果。如产生补体依赖的毒性作用、ADCC及免疫调理作用等。此外，通过双特异性抗体、独特型抗体研究和噬菌体呈现技术制备人缘化抗体等，针对抗体的结构进行的各种改造，对提高