流式细胞仪-上课-2014

2019/12/231流式细胞仪沈素芹2019/12/232•流式细胞仪概况•工作原理及数据分析•DNA分析原理、应用、实验步骤、注意事项•T淋巴细胞亚群分析原理、应用、实验步骤、注意事项•流式细胞仪的其他应用主要内容2019/12/233什么是流式细胞仪●流式细胞仪实物BD-CaliburBeckman-CoulterGallios2019/12/234BCMoFloXDP对比流式细胞仪是一种特殊的显微镜流式细胞仪显微镜流动的细胞静止的细胞样本数量大数量少高速分选样本难以再利用细胞群体特征量分布可以揭示细胞内部结构信息流式细胞仪蛋白胶多参数单参数量化的分布平均值容易检测各个参数间的相关性不容易2019/12/237流式细胞仪的特点单个细胞分析同时多参数分析速度快：70000个细胞/秒统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况分选感兴趣的细胞原子0.1nm1nm10nm100nm1μm10μm100μm1mm氨基酸蛋白质病毒支原体细菌红细胞上皮细胞植物细胞电镜光学显微镜人眼极限当前流式细胞仪可测量颗粒大小最小约0.2μm测量对象：颗粒尺度（单细胞悬浮液）流式细胞仪的测量对象大小悬浮在溶液中的相互离散颗粒。大小范围：0.2uM-300uM。对象类型细胞类型：（1）高等真核细胞；（2）酵母；（3）细菌；（4）多细胞的聚集体，如胰岛等。非生命颗粒：细胞核、染色体、和其它细胞器以及乳化微球等。2019/12/2310细胞结构细胞大小细胞粒度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量染色体分析细胞功能细胞表面/胞浆/核的特异性抗原细胞活性细胞内细胞因子酶活性激素结合位点细胞受体细胞凋亡在上述信号基础上的细胞分选流式细胞术的细胞学应用2019/12/23111980.1以前：1421980.1—1990.1:94501990.1—2000.1:334592000.1—2005.1:288502005.1—2010.1:373042010.1—2014.10.21:46813美国国立生物技术信息中心查询：检索关键词：flowcytometry结果：NCBI科技文献统计◇HIV感染与病程动态监测：辅助T淋巴细胞的绝对计数；◇癌症动态及治疗方案：细胞DNA含量和增殖活性；◇器官移植：交叉配型；◇分选人类染色体，建立遗传文库（geneticlibraries）；◇动物育种的性别选择：分选含x或y染色体的精子；◇人类体外受精；◇造血干细胞和其他一大类干细胞各个分化层次鉴别；◇海洋、环境微生物研究，发现未知种属。几个著名的实际应用：2019/12/2313•流式细胞仪概况•工作原理及数据分析•DNA分析原理、应用、实验步骤、注意事项•T淋巴细胞亚群分析原理、应用、实验步骤、注意事项•流式细胞仪的其他应用主要内容+SurfacePhenotyping+IntracellularHOW?2019/12/2315将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。工作原理2019/12/2316流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下,产生散射光和激发荧光。这两种信号分别被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。工作原理2019/12/2317散射光信号荧光信号流式细胞仪的光信号2019/12/23181.散射光信号•前向角散射光（FSC,ForwardScatter）入射激光的前向散射光信号，与细胞相对大小及其表面积正相关，确切地说，它与细胞直径的平方值密切相关。通常在FCM应用中，选取FSC作阈值，来排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒，以避免对被测细胞的干扰。前向散色光FSC2019/12/23201.散射光信号侧向角散射光（SSC,SideScatter）入射激光90角的散射光信号，侧向散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息。与细胞粒度及细胞内相对复杂性正相关。侧向散色光SSC2019/12/2322外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后）10to14μm15to20μm8to10μm2019/12/23232.荧光信号荧光素与特异抗体结合荧光素吸收激光能量荧光素将吸收能量释放，释放较入射光波长更长的光量子即检测的发射波长荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强有荧光标记的细胞与无荧光标记的区分开来（阴阳）高FL细胞与低FL细胞区分开来（强弱）多荧光标记胞内多种组分，实现多参数测量FL-AFL-HFL-W面积（A）：荧光总量高度（H）：最大荧光强度宽度（W）：细胞直径PMT：光信号到电脉冲信号高灵敏度—50MESF线性放大器对数放大器荧光测量流式细胞仪测定的结果百分比——目标细胞占选定细胞群或所有细胞的比例绝对浓度——目标细胞在样本中的浓度（cells/ul)荧光强度——与被检测物质的表达量有关，在正态分布时一般用该值。变异系数——所有目标细胞表达某一个蛋白的离散程度HistogramplotOverlayplot数据分析：流式报告中常见的几种流式细胞图图中0～100为阴性细胞，100以上的（B）为阳性细胞2019/12/2328ContourplotDensityplotColordotplot2019/12/2329PRISM浓缩柱形图Tomogram2019/12/2330细胞分类-门的选择2019/12/2331•流式细胞仪概况•流式细胞仪的工作原理及数据分析•DNA分析原理、应用、实验步骤、注意事项•T淋巴细胞亚群分析原理、应用、实验步骤、注意事项•流式细胞仪的其他应用主要内容2019/12/2332G1SphaseG2MG1121DNA含量G1MG2SG0静止细胞TheCellCycle理论基础PropidiumIodide荧光染料PI（碘化丙啶）是一种可对双链DNA染色的细胞核染色试剂，PI-DNA复合物的激发和发射波长分别为535nm和615nm.荧光强度与PI的结合量呈良好的线性关系.DNA含量G1SG2M细胞数目2019/12/2335典型的细胞周期结果图G1SG2Example1:ComparecyclesDay1Day3生物学应用G1SG2Example2:SphaseblockT0T24G1SG2Example3:G2blockT0T24Fluorescentprotein+DNA:AssessmentofcellcycleHoechst33342GreenFluorescentProteinG1SG2/M2019/12/2340动物细胞倍体相关基因的研究2019/12/2341细胞同步化的检测植物细胞DNA倍体检测2019/12/2342肿瘤诊断DNA异倍体的出现是癌变的一个重要标志细胞的增殖能力的大小也可反映肿瘤的生物学特征利用流式细胞仪进行细胞周期分析和DNA倍性分析，辅助肿瘤诊断，包括监测癌前病变、肿瘤的早期诊断和肿瘤细胞学诊断。2倍体异倍体4倍体肿瘤组织中的各种DNA倍体实验步骤1.取对数期生长细胞，倒去培养液，胰酶适度消化细胞，用培养液吹打，1000rpm，离心5min弃上清；2.PBS洗2次，加1ml吹匀，务必吹散；3.加入70%预冷乙醇中（标准做法是将细胞悬液加入预冷70％酒精），固定时可加入TritonX-100以增加膜的通透性）封口膜封口，4℃固定1-2h或过夜（可长至一个月）；4.1000rpm×5min离心收集细胞，PBS洗两次；5.用0.4mlPBS重悬细胞并转移至离心管中轻轻吹打；6.加入Rnase-A约3ul至终浓度50ug/ml，37℃水浴消化30min；7.加入PI约50ul至终浓度约为5-50ug/ml，室温避光染色10min；8.用300目滤网过滤，上机检测。2019/12/2346R1UngatedGatedDoubletsRemovalofcellclumps注意事项2019/12/2348•流式细胞仪概况•流式细胞仪的工作原理及数据分析•DNA分析原理、应用、实验步骤、注意事项•T淋巴细胞亚群分析原理、应用、实验步骤、注意事项•流式细胞仪的其他应用主要内容细胞免疫功能检测——T细胞亚群、B细胞、NK细胞检测原理不同功能的免疫细胞表面表达不同种类的特征性分子细胞表面分化族(clusterdifferentiation,CD)细胞表面分化族(clusterdifferentiation,CD)T细胞表面分化族：CD3+CD3+CD4+T淋巴细胞CD3+CD8+T淋巴细胞B细胞表面分化族:CD19+NK细胞表面分化族:CD16+/CD56+2019/12/2351FSC/SSC区分淋巴细胞2019/12/2352运用CD3/CD19来鉴定T淋巴细胞和B淋巴细胞2019/12/2353运用CD3/CD4来鉴定CD4+T淋巴细胞2019/12/2354运用CD3/CD8来鉴定CD8+T淋巴细胞2019/12/2355运用CD16+CD56/CD3-来鉴定NK细胞淋巴细胞亚群2019/12/2356健康人淋巴细胞亚群正常值CD3955～2860/μl59.4~84.6%CD19103～363/μl6.4~22.6%CD4450～1440/μL28.5~60.5%CD8320～1250/μL11.1~38.3%CD16/5660～3605.6~30.9%CD4/CD80.9~3.62019/12/2358实验步骤1.采集血液样品，取100ul抗凝全血加入每支试管中，注意不要碰到管壁。2.轻轻混匀，依次加入20ulIsotypeControl(如没有的话用没染色细胞代替)，另外几管加入10μl荧光抗体。室温避光保存20分钟。3.加入1×红细胞溶解液1ml，涡旋混匀避光保存5min，待管内液体透亮，300-500g离心5min，去上清4.加PBS2mlPBS涡旋混匀，300-500g离心5min，弃上清，然后加0.5mlPBS摇匀。过300目尼龙网，4℃避光1h内上机检测；2019/12/23592019/12/2360•激发光源与荧光标记物的匹配•荧光标记物与滤色片的匹配注意事项荧光素的选择原则弱表达抗原选择较“明亮”的荧光素细胞内抗原检测优先选择小分子荧光素多色检测时弱表达抗原放在被干扰较小的检测通道，强表达抗原放在对其他通道干扰较小的检测通道表达互相排斥的抗原可以放在相互干扰较大的检测通道共表达的抗原避免放在相互干扰的通道上级抗原检测通道避免对下级抗原检测通道造成干扰2019/12/2362荧光补偿2019/12/2363UncompensatedvsCompensated2019/12/2364•流式细胞仪概况•流式细胞仪的工作原理及数据分析•DNA分析原理、应用、实验步骤、注意事项•T淋巴细胞亚群分析原理、应用、实验步骤、注意事项•流式细胞仪的其他应用主要内容2019/12/2365细胞膜的变化DNA含量的变化酶活性线粒体膜电位变化侧向散射光细胞凋亡分析Annexin-V检测细胞凋亡在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。AnnexinV是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此AnnexinV被作