毒理学评价

塔里木大学1食品毒理学苏丹红安全性毒理学评价组员：李润之周丹罗慧沈永娟郭丽伟管健王申杰塔里木大学2班级：食品质量与安全15-2指导老师：郭东起老师苏丹红安全性毒理学评价李润之周丹罗慧沈永娟管健郭丽伟王申杰指导老师：郭东起摘要本试验用昆明种小白鼠对苏丹红Ⅰ进行了较系统的毒理学试验包括急性毒性试验、亚急性毒性试验。在对小鼠进行以苏丹红Ⅰ绝对致死量(LD100)和最大耐受量(LD0)测定的基础上制定急性毒性试验用药剂量范围进小鼠急性毒性试验并确定苏丹红Ⅰ的半数致死量(LD50)参照小鼠1/7-1/28LD50确定试验用药最高剂量以昆明种小白鼠为动物模型进行亚急性毒性试验。研究苏丹红Ⅰ对小鼠外周血细胞和肝、脾、肾的毒性和的损伤作用并对其毒性作用机理进行了初步探讨为全面评价苏丹红Ⅰ对哺乳动物的毒理效应提供科学依据。通过显微和超微结构的观察证明苏丹红Ⅰ能够导致小鼠肝、脾、肾各织织发生损伤使其生理机能降低。不同剂量苏丹红Ⅰ染毒后病理组织结构变化的差异为判断和分析苏丹红Ⅰ中毒效应提供了充分的形态依据。关键词苏丹红Ⅰ小鼠；半数致死量；急性毒性试验；亚急性毒性试验1引言民以食为天食品是人类赖以生存和发展的最基本的物质条件。在我国国民经济中食品工业己成为第一大产业。根据有关资料显示早在1993年至1998年我国食品工业总产值由3430亿元增至6000亿元平均每年递增12℅。2003年我国食品工业总产值是首破12000亿元远远超过汽车工业总产值9400亿元的水平。但是全球及我国接连不断发生的恶性食品安全事故引发了人们对食品安全的高度关注也促使各国政府重新审视这一己上升到国家公共安全高度的问题各国纷纷加大了对本国食品安全的监管力度。2003年4月16日我国国家食品药品监督管理局正式挂牌标志着我国食品安全工作迈入了综合监管与具体监管相结合的新阶段也表明了我国政府与时俱进、切实抓好食品安全工作的决心。然而有关食品安全的负面消息依然不断阜阳劣质奶粉、致癌毒大米、山东“掺胶”龙口粉丝、苏丹红致癌、南京冠生园月饼。在我国无论食源性疾病还是化学性污染物对公众健康的危害都以惊人的速度上升。苏丹红系列染料是人工合成亲脂性偶氮化合物。因其对光线的敏感性不强物品被染色后能长期保持颜色不容易褪色所以在社会各个领域都得到了广泛的应用。20世纪70年代以后食品、医药和化妆品领域才禁止苏丹红的使用。而后苏丹红做为化工染料主要用于彩色蜡、地板蜡、油脂、汽油和鞋油等的增色添加剂还可以用于焰火礼花的着色[1]。研究表明苏丹红Ⅰ可引起大鼠肝脏癌变但对小鼠没有致癌性目前尚无充分的证据证明对人体有致癌性。国际癌症研究中心(IARC)在其1999年公布的对人致癌性总评价表中将苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ定义为对人致癌性尚无法分类的物质[3]最近国际癌症研究机构对苏丹红的致癌作用进行了分析评价将其归类为三类致癌物但这种致癌物进入人体后代谢为二类致癌物即人类可能致癌物。1995年欧盟(EU)国家己禁止其作为色素在食品中添加。1996年我国在《食品添加剂使用卫生标准》中也禁止将苏丹红作为食品添加剂使用[1]。但由于其染色鲜艳、价格低廉印度等一些国家在加工辣椒粉的过程中添加苏丹红。2003年初欧盟(EU)从印度进口的红辣椒中检出苏丹红Ⅰ同时在一些其它食品中也检测到这种物质为此欧洲委员会(EC)于2003年6月底发布禁止进口含有苏丹红Ⅰ的红辣椒及红辣椒制品的禁令[4]12月EC的禁令产品从苏丹红Ⅰ扩大Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ四种[5]。2005年2月18日英国食品标准署向消费者发出警告并在其网站上公布了亨氏、联合利塔里木大学3华等30家企业生产的可能含有苏丹红Ⅰ的359个品牌的食品之后又扩大到651种包括香肠、泡面、熟肉、馅饼、辣椒粉、调味酱等产品引起了世界对苏丹红染料的注意。我国也相继在辣椒调味品、唇膏等产品中发现苏丹红甚至出现个别地区禽蛋经销商非法兜售苏丹红给养殖户让他们添加苏丹红饲喂蛋鸡和蛋鸭生产所谓的营养成分高的“红心蛋”。对此中国国家质检总局在2005年2月23日发出紧急通知禁止含有苏丹红的食品进入我国流通领域并联合卫生部、农业部等部门在全国范围内对苏丹红进行彻查。1.1苏丹红的理化性质及应用苏丹红(Sudan)主要包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ四种类型。其中苏丹红Ⅰ和苏丹红Ⅱ属于单偶氮化合物苏丹红Ⅲ和苏丹红Ⅳ属于重偶氮化合物。苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ和苏丹红Ⅳ均为苏丹红Ⅰ的化学衍生物[6]。苏丹红Ⅰ为暗红色苏丹红Ⅱ为红色苏丹红Ⅲ为有绿色光泽的棕红色苏丹红Ⅳ为深褐色。在标准状态下其溶解度均小于0.01g易溶于有机溶剂。1.2苏丹红的摄入及体内代谢1.2.1苏丹红的机体摄入途径经食物从口摄入是苏丹红染料进入机体的主要途径。人类皮肤对苏丹红的吸收率较低24小时吸收率为26.4%±6.75%小鼠为32.8%±2.8%而裸豚鼠则高达57.6%±5.9%[8]。1.2.2苏丹红的可能暴露量欧洲调味品协会专家委员会(Theexpertcommitteeonflavouringsofthecouncilofeurope)的资料信息显示欧洲每天红辣椒粉的人均消费量为50-500mg而红辣椒粉中苏丹红Ⅰ的检出量为2.8-3500mg/kg从而推算欧洲人每天苏丹红Ⅰ的人均可能摄入量为0.14-1750ug。而在法国向欧洲调味品协会专家委员会提交的一份报告中指出人均每天辣椒(包括红辣椒和辣椒粉)的消费量和最大消费量分别为77mg和264mg按辣椒粉中苏丹红Ⅰ的检出量2.8-3500mg/kg进行推算欧洲人每天人均苏丹红Ⅰ的摄入量为0.2-270ug最大摄入量为0.7-924ug。目前我国尚缺乏关于苏丹红人群暴露水平的数据。目前我国尚缺乏关于苏丹红人群暴露水平的数据。苏丹红在食品中非天然存在但在许多食品中天然存在一些胺类物质如有研究报道在新鲜水果和蔬菜中可检出0.6-30.9mg/kg的苯胺在大白菜中可检出22mg/kg的苯胺在胡萝卜中可检出30.9mg/kg的苯胺并可在红茶和蒜汁的挥发性成分中检出。在胡萝卜中可检出7.2mg/kg的甲苯胺在芹菜和甘蓝菜中检出l.lmg/kg的甲苯胺[1]。1.2.3苏丹红的代谢产物进入体内的苏丹红主要通过胃肠道微生物还原酶、肝和肝外组织微粒体和细胞质的还原酶进行代谢在体内代谢成相应的胺类物质。在多项体外致突变试验和动物致癌试验中发现苏丹红的致突变性和致癌性与代谢生成的胺类物质有关。苏丹红Ⅰ在体内可以被还原代谢为初级产物苯胺(aniline)和1-氨基-2-萘酚(1-amino-2-naphthol)。苏丹红Ⅱ在体内代谢可产生2,4-二甲基苯胺(2,4-xylidine)和1-氨基-2-萘酚。苏丹红Ⅲ在体内代谢可产生4-氨基偶氮苯(4-aminoazobenzene)、1-氨基-2-萘酚、苯胺、对苯二胺(p-phenylenediamine)和1-(4-氨基苯基)偶氮-2-萘酚[1-(4-aminophenyl)azo]-2-naphthol]。苏丹红Ⅳ在体内代谢可产生邻-氨基偶氮甲苯(ortho-aminoazotoluene)、1-(4-氨基-2-甲苯基)偶氮-2-萘酚[1-(4-amino-2-methylphenyl)azo]-2-naphthol]、2,5-二氨基甲苯(2,5-diaminotoluene)、1-氨基-2-萘酚和邻-甲苯胺(ortho-toluidine)。苏丹红Ⅲ的代谢产物4-氨基偶氮苯和苏丹红Ⅳ的代谢产物邻-氨基偶氮甲苯、邻-甲苯胺为人类可能致癌物[1]。1.2.4参与苏丹红代谢的主要酶系参与苏丹红体内代谢的主要酶系有肝和肝外组织微粒体、细胞质的细胞色素还原酶系和过氧化氢-过氧化物酶体系也有报道前列腺素H合酶(PHS)在花生四烯酸或过氧化氢条件下参与苏丹红的代谢活化。细胞色素氧化酶系P450(CYP)是致癌物代谢活化的重要酶系之一。早期报道苏丹红代谢以大鼠肝微粒体以及植物微粒体试验为主[9]近年来陆续出现了人肝脏微粒体参与苏丹红染料代谢活化的报道。大鼠CYP1A1以及重组人CYP1A1是最有效的参与苏丹红代谢的酶。应用Westernblot实验证明人肝脏微粒体中的9个氨基酸蛋白条带与抗大鼠CYP1A1呈现交叉反应。LFPISMSAT分析显示人微粒体CYP1A1高度匹配(残基2-10)。所有人肝脏微粒体样本都能氧化苏丹红Ⅰ使其代谢为C-羟基代谢物[10]。对8名美国白种人肝脏捐赠者的实验表明苏丹红Ⅰ导致捐赠塔里木大学4者肝脏表达CYP1A1其水平高低与苏丹红Ⅰ氧化代谢的活性高低相关在肝微粒体代谢活化苏丹红Ⅰ形成致癌物的反应中占10%至30%[11]。进一步证明了人肝脏微粒体酶参与苏丹红染料的代谢活化。在花生四烯酸或过氧化氢条件下前列腺素H合酶(PHS)将苏丹红Ⅰ转化为6-羟基-苏丹红Ⅰ经氧化代谢形成1-苯偶氮基-2,6-萘醌。这一过程可被自由基清除剂亚苏丹红Ⅰ、维生素C、谷胱甘肽和还原型辅酶Ⅰ抑制。提示PHS对6-羟基-苏丹红Ⅰ的代谢是一个单电子氧化机制氧化过程中产生自由基[11]。1.3苏丹红的毒理学研究1.3.1遗传毒性进入体内的苏丹红激活相关酶体系在酶的催化作用下形成多种代谢产物其中一些代谢谢产物其中一些代谢产物可诱导细胞内核物质的损伤或与DNA、RNA形成加合物在多项体外致突变试验和动物试验中均证实了苏丹红的致突变性作用。(1)苏丹红诱导细胞微核形成Elliott等通过口饲法分别给予大鼠5000mg/kg和小鼠2000mg/kg苏丹红Ⅰ进行体内骨髓微核遗传毒性试验和大鼠肝非程序性DNA合成实验。结果证明苏丹红Ⅰ对大鼠和小鼠骨髓都具有遗传毒性但前者较明显后者较弱[12]。苏丹红Ⅰ还可导致F344大鼠多染性红细胞微核率的增加[13](2)DNA加合物的形成苏丹红Ⅰ可通过CYP1A1在人肝微粒体中代谢其代谢产物与DNA形成加合物[14]。该加合物与苏丹红Ⅰ在大鼠微粒体酶作用下生产的DNA加合物是相同的。在试验中还发现苏丹红I号在HepG2细胞中产生的遗传毒性可能与氧化性DNA损伤有关[15]。(3)RNA加合物的形成纤维素薄层层析共同色谱分析显示苏丹红经过氧化物酶催化产生的代谢产物与tRNA、均聚核苷酸和5'-磷酸核苷形成加合物[11]。HPLC检测技术也证实tRNA更容易被苏丹红染料代谢产物所修饰形成tRNA加合物。这一反应可被维生素C、谷胱甘肽和镁离子抑制。苏丹红Ⅰ修饰的tRNA经酶水解后可被HPLC分离出多种核苷说明不止一种核苷被共价修饰形成tRNA加合物。(4)体外试验致突变作用研究显示苏丹红Ⅰ及其代谢产物1-氨基-2-萘酚在S-9存在的条件下对鼠伤寒沙门氏伤寒沙门氏菌具有致突变作用对小鼠淋巴瘤L5178YTK+/-细胞具有致突变作用可增加CHO细胞姐妹染色单体交换彗星试验表明可引起小鼠胃和结肠细胞的DNA断裂。苏丹红Ⅱ在FMN改良试验中对TA98,TA1537,TA1538和TA98有致突变性[17]。苏丹红Ⅲ在有无S-9存在的条件下对沙门氏菌TA98,TA100和TA1537有致突变作用[18]。在代谢活化的作用下苏丹红Ⅲ可增加CHO细胞姐妹染色单体互换[19]。1.3.2致癌性国际癌症研究机构(InternationalAgencyforResearchonCancerIARC)将苏丹红Ⅰ及其代谢产物苯胺、苏丹红Ⅱ及其代谢产物2,4-二甲基苯胺、苏丹红Ⅲ和苏丹红Ⅳ归为三类致癌物即动物致癌物主要基于体外和动物试验的研究结果尚不能确定对人类有致作用将苏丹红Ⅲ的初级代谢产物4-氨基偶氮苯和苏丹红Ⅳ初级代谢产物邻-甲苯胺、邻-氨基偶氮甲苯被列为二类致癌物即对人可能致癌。苏丹红Ⅰ产生致癌性的主要靶器官是肝脏此外还可引起膀胱、脾脏等脏器的肿瘤。用苏丹红Ⅰ喂饲F-344大鼠(剂量为15mg/kg和30mg/kg)和B6C3F1小鼠(剂量为60mg/kg和120mg/kg)103周后与对照组比暴露组大鼠的体重轻度减少在雌性剂量组中发现了大鼠的肾脏非肿瘤损害雌雄高剂量组大鼠肝癌的发生率较对照组显著升高这提示苏丹红Ⅰ可能诱导大鼠肝癌的发生雌性低剂量组小鼠白血病和淋巴瘤发