比较基因编辑技术

比较基因编辑技术（NgAgo-gDNA）和（CRISPR-Cas9）的原理，并阐述二者在分子遗传学中的应用或前景CRISPR-Cas系统[ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats(CRISPR)&CRISPR-associatedgenes(Cas)]：一个有效的CＲISPＲ/Cas系统包括3个部分:CＲISPＲ位点上游的前导序列，由高度保守的重复序列(repeat)和各不相同的间隔序列(spacer)有规则排列的CＲISPＲ簇及Cas基因。CＲISPＲ位点上游存在一段(A+T)富集的前导序列，其在CＲISPＲ/Cas系统转录过程中起启动子的作用。CＲISPＲ－Cas系统能够将短序列的外源基因整合到CＲISPＲ的2个重复序列中，当有外源基因入侵时，间隔序列转录并加工成非编码ＲNA与特异的Cas蛋白组成复合物，结合并剪切与之匹配的外源基因。Cas9蛋白中含有的结构域，包括核酸内切酶核酸外切酶解旋酶聚合酶和ＲNA结合蛋白，Cas蛋白参与CＲISPＲ的转录加工等过程。作用机制：（1）新的间隔序列的获取：间隔序列的获取大概分成3个步骤:对入侵核酸的识别和扫描，寻找潜在的PAM(protospaceradjacentmotifs)序列并通过PAM序列来决定间隔序列前体(protospacer)的具体位置;通过对入侵核酸中所决定的间隔序列前体的切割产生新的间隔序列;将间隔序列插入靠近CＲISPＲ引导序列的2个重复序列之间（2）CＲISPＲ系统的表达：整合后的间隔序列首先被转录为蛋白结合形成CＲISPＲ相关核糖核蛋白复合物(CＲISPＲ－associatedribonucleoproteincomplexes)，通过扫描外源基因的PAM序列，crＲNA与外源基因的相应靶位碱基互补配对结合，最后复合物所含的核酸酶将外源DNA降解。（3）基因的敲除或敲入：CＲISPＲ/Cas系统对外源基因的切割和降解，需要crＲNA和tracrＲNA介导tracrＲNA的5'端序列和crＲNA的3'端保守序列通过碱基互补配对形成一个杂交的分子，这个杂交的分子通过其特殊的空间结构和Cas9相互结合形成一个蛋白－ＲNA复合物，该复合物通过crＲNA的5'端特异性的20个碱基与靶标基因相结合，从而指引Cas9的2个内切酶活性中心切断双链的DNA，造成双链断裂。NgAgo-gDNANgAgo：来自格氏嗜盐碱杆菌SP2菌株的Argonaute蛋白，NgAgo当与5’端发生磷酸化的单链gDNA结合时能够在37°C下切割靶双链DNA。相对于CRISPR-Cas9编辑技术，gDNA为24个核苷酸的单链，比CRISPR-Cas9中的RNA多了5个碱基长度，理论上其精确性要提高1024（4的5次方）倍；NgAgo–gDNA系统对向导序列-靶序列错配容忍度很低。gDNA上任何一个碱基的变换都会降低NgAgo的切割效率，如有三个错配则使其完全失活。这在另外一个机制上提高了NgAgo使用的精确性，特别是一些富含GC序列的地方，NgAgo系统比Cas9系统效率更高；NgAgo的gDNA需要5’端磷酸化的单链DNA（5p-ssDNA），这种形式的DNA在哺乳动物细胞中几乎不存在，这保证了NgAgo不会被内源的DNA序列错误带到不该去的地方；该系统的另外一个优点是5p-ssDNA是外源转化进细胞的，其时间和浓度可以非常精确地控制。而Cas9系统的gRNA是内源表达的质粒，难以精确地控制；正确的Cas9结合要求向导RNA必须有一个3′RNA-RNA杂化结构，而Argonaute结合则不要求特异的一致的向导RNA二级结构；Cas9只可以切割PAM上游的靶序列，而Argonaute不要求靶序列上存在特异的序列。综合，该项技术具有以下明确优势：1.向导设计制作简便：可以像合成PCR引物一样合成短链单链DNA向导；向导可直接转染细胞和组织而无需构建向导表达载体。2.可编辑基因组内任何位置：Cas9基因组的靶点选择受到PAM区和富含GC区的限制。而NgAgo对靶点选择没有限制，对基因组任何位置都能有效引入双链断裂。3.由于向导核酸是DNA而非RNA，因此避免了RNA易于形成复杂的二级结构而带来的失效或者脱靶效应。4.对游离于细胞核的DNA具有更高的切割效率应用NgAgo-gDNA：该技术可用于微生物、植物和动物的精准基因改造，以及乙肝、艾滋病或者一些遗传性疾病的“基因治疗”，在人类血液、器官的编辑和再造等方面具有重要意义，在医药，农业，畜牧等产业领域具有重要应用价值CＲISPＲ/Cas9为基础的基因编辑技术在基因治疗领域展现出极大的应用前景，如血液病肿瘤和一些其他遗传疾病，但目前对CＲISPＲ/Cas9系统的了解还不够全面，还有很多问题尚未研究清楚CＲISPＲ/Cas9系统可编辑基因组中特定靶位点的遗传信息，但该系统有可能会结合意想不到的位点，导致一些位点发生突变产生脱靶问题，影响将来临床应用的有效性和安全性问题。华南植物园杨慧芳201528010715024