第七章-体外抗原抗体反应概述

第七章体外抗原抗原反应概述抗原抗体反应：是指抗原与相应抗体的特异性结合反应体内杀菌、溶菌、调理、中和毒素免疫病理损伤—超敏反应、免疫性疾病等体外：凝集、沉淀、溶细胞、中和毒素、补体结合等第一节抗原抗体反应的原理抗原抗体结合反应是抗原决定簇和抗体分子超变区之间的相互作用，是一种分子表面的特异的可逆的弱结合力（只能在极短距离内才能发生效应）。抗原抗体结合反应的条件：①抗原与抗体间的特定部位的空间结构必须相互吻合，具有互补性（先决条件）;②抗原决定簇与抗体超变区必须紧密接触，才能有足够的结合力，使抗原抗体分子结合在一起。不形成牢固的共价键，通过非共价键结合这种弱的结合力涉及几种分子间的作用力一、抗原抗体的结合力1、静电引力2、范德华引力3、氢键4、疏水作用力1、静电引力概念：抗原和抗体分子带有相反电荷的氨基和羧基基团之间相互的引力。又称库伦引力。静电引力的大小与两个相互作用基团间的距离的平方成反比。二、范德华引力概念：抗原和抗体相互接近时，各自所携带的原子与原子、分子与分子由于分子极化作用而出现的引力。•结合力的大小与两个相互作用基团的极化程度的乘积成正比、与它们之间距离的7次方成反比。•作用力最小•作用大小取决于二者分子空间构型的互补性•概念：供氢体上的氢原子与受氢体原子间的引力。三、氢键结合力•供氢体：－COOH、－NH2和－OH•受氢体：氧、氮氢键结合力与供氢体和受氢体之间距离的6次方成反比。最具特异性（必须供氢体和受氢体互补才能实现氢键的结合）四、疏水作用力（疏水键）•概念：两个疏水基团在水溶液中相互接触时，由于对水分子排斥而趋向聚集的力。•抗原决定簇与抗体上的结合点靠近，互相间正、负极性消失，亲水层立即失去。•结合力最强，约占总结合力的50％。静电引力：异性相吸（electrostaticforces）范德华引力:作用最小（vanderWaalsinteractions）氢键:最具特异性（hydrogenbond）疏水作用力:作用最大（hydrophobicinteractions）抗原抗体结合力示意图抗原抗体结合力结合力的大小亲和力（affinity）表示亲合力（avidity）二、抗原抗体的亲和力和亲合力亲和力（affinity）：是抗体分子上一个抗原结合点与相应的抗原决定簇之间的相适应而结合的强度，是抗原与抗体间固有的结合力。亲和常数（K）：K值越大⇨抗体的亲和力越高⇨与抗原结合越牢固抗体与抗原结合是可逆的反应，在平衡时其亲合力（avidity）：是指一个抗体分子与整个抗原表位之间结合的强度，与抗体结合价直接相关。另外也与亲和力强弱有关。与抗体的结合价直接相关。亲合力高，与抗原结合牢固不易解离。Avidity•TheoverallstrengthofbindingbetweenanAgwithmanydeterminantsandmultivalentAbsKeq=104Affinity106Avidity1010Avidity亲水胶体疏水胶体转化NaCl可见反应血清学反应条件下，抗原抗体均带负电荷，使极化的水分子在其周围形成水化层，成为亲水胶体。当抗原与抗体结合使表面电荷减少，水化层变薄，失去亲水性能，抗原抗体复合物成为疏水胶体在电解质作用下，中和胶体粒子表面的电荷，使各疏水胶体之间靠拢，形成可见的抗原抗体复合物三、亲水胶体转化为疏水胶体第二节抗原抗体反应的特点1.特异性2.比例性3.可逆性4.阶段性一、特异性（specificity）1、概念：一种抗原分子通常只能与其刺激机体后产生的抗体结合，这种抗原与抗体结合反应的专一性称为特异性。特异性示意图2、决定因素：由抗原决定簇和抗体分子超变区之间空间结构的互补性决定的。3、应用：由于抗原抗体反应具有高度特异性，故可用已知的抗原（抗体）来检测相应未知的抗体（或抗原）。概念：两种不同的抗原分子具有部分相同或类似结构的抗原表位，可与彼此相应的抗血清发生反应。4、交叉反应（crossreactions）抗原抗体交叉反应示意图B三、比例性（proportionality）1、比例性是指抗原与抗体发生可见反应遵循一定的量比关系。2、以絮状沉淀实验为例，受抗原抗体比例性的影响非常明显。3、根据所形成的沉淀物及抗原抗体比例关系绘制反应曲线。网格学说（图）抗体的两个Fab段分别结合两个Ag分子，相互交叉结合连接成巨大的网格状立体聚合物，（可见）。二者比例合适：Ab/Ag过剩过剩方的结合价得不到饱和，大多数游离存在，只形成小分子复合物（不可见）。最适比(optimalratio)：是指形成沉淀物最多，上清液清晰，几乎无游离抗原或抗体的抗原抗体浓度比。等价带(equivalencezone)：形成沉淀物最多的抗原与抗体分子比例合适的范围。带现象：在等价带前后，由于抗体和抗原过量，形成的沉淀物少，上清液中可测出游离的抗体或抗原的现象。前带(prozone)抗体过量时称为。后代(postzone）抗原过量时称为。5、一组概念带现象包括在抗原抗体反应中，抗体（或抗原）与一定量的对应物结合出现可见反应所需的最小量称为效价（或滴度），一般以最高稀释倍数表示，正好是稀释度的倒数。三、可逆性（reversibility)1、概念：是指抗原与相应抗体结合成复合物后，在一定条件下可解离为游离抗原与抗体的特性称为抗原抗体结合的可逆性。2、原因：抗原抗体的结合是分子表面的非共价键结合，因此形成的复合物不牢固。3、抗原抗体反应动态平衡式如下：4、决定抗原抗体解离的因素（1）抗体与相应抗原的亲合力。亲合力低的抗体与抗原形成的复合物较易解离。（2）环境因素对复合物的影响。PH过高或过低、增加离子强度均可破坏静电引力，使抗原抗体结合力下降，促使其解离。注意：解离后的抗原或抗体仍然保持其原有生物活性四、阶段性特异性结合两个阶段可见反应阶段数秒～数分钟，肉眼不可见数分～数小时肉眼可见第三节抗原抗体反应影响因素一、反应物自身因素1.抗原：理化特性、Ag决定簇数量和种类。例如，可溶性抗原与相应抗体反应出现沉淀，而颗粒性抗原与相应抗体反应则出现凝集;单价抗原与抗体结合不出现可见反应;粗糙型细菌在生理盐水中易出现自凝；红细胞与IgG类抗体结合不出现直接凝集等。•抗体是血清学反应中的关键因素，对反应的影响表现在以下三个方面:•(1)来源:来自不同动物的免疫血清，其反应性有差异。家兔等大多数动物的免疫血清具有较宽的等价带，通常在抗原过量时才易出现可溶性免疫复合物;马等大动物和人的免疫血清等价带较窄，少量的抗原或抗体过剩，均可形成可溶性免疫复合物.2.抗体(2)特异性与亲和力:•特异性和亲和力是影响血清学反应的两个关键因素，它们共同影响试验结果的准确程度。•免疫动物早期获得的抗血清特异性较好，但亲和力低;后期获得的抗血清一般亲和力较高，但长期免疫易使免疫血清中抗体的类型和反应性变得更为复杂。因此，用于诊断的试剂必须尽量选用特异性高、亲和力强的抗体，才能保证和提高试验结果的可靠性。（3）浓度:抗体的浓度往往是与抗原相对而言。合适的浓度才出现明显的反应现象。因此许多试验应进行抗体预滴定，找出最适反应浓度。电解质:生理盐水或缓冲液酸碱度:pH6～pH8温度:15℃～40℃，37℃最适二、环境因素（一）电解质•抗原抗体结合后由亲水性变为疏水性，此时易受电解质影响，如有适当浓度电解质存在，就会使抗原抗体失去一部分电荷而相互凝集或沉淀，出现可见反应;若无电解质存在，则不出现可见反应。通常在血清学试验中，以8.5g/LNaCl溶液作为抗原抗体的稀释液及反应液，其中Na+和Cl-可分别中和胶体颗粒上的电荷，使胶体颗粒的电势下降，形成可见的沉淀物或凝集物。但如果电解质浓度过高，则会出现非特异性蛋白质沉淀，即盐析。补体参与的溶细胞反应，除需要等渗的NaCl溶液外，还需适虽的Mg2+和Ca2+离子参与。（二）酸碱度•Ag、Ab多为蛋白质，具两性电离特性，有其故有的PI,pH过高或过低均可影响Ag、Ab反应。•一般：pH6～8为宜，补体参与时pH7.2～7.4。•注意：自凝现象------即pH达到或接近颗粒性抗原的PI时，引起的抗原非特异性自身凝集现象。（三）温度—影响反应速度一般：15～40℃为宜，最适温度：37℃,过高（56）:Ag-Ab解离，Ag、Ab变性，补体失活。冷凝集实验：4℃凝集，20解离。（四）其他振荡、搅拌等可加速反应第四节抗原抗体反应类型1.沉淀反应2.凝集反应3.补体参与的反应4.中和反应5.标记免疫反应表抗原抗体反应的基本类型表反应类型实验技术检测方法敏感度沉淀反应液相沉淀试验观察沉淀、检测浊度+，++++琼脂凝胶扩散观察扫描沉淀线或环+凝胶电泳技术或峰或弧++补体参与反应补体溶血试验以裸眼或光电比色仪++补体结合试验观察测定溶血现象+++免疫标记技术荧光免疫技术检测荧光现象++++放射免疫技术检测放射性++++酶标免疫技术检测酶底物显色++++发光免疫技术测定发光强度++++生物素-亲合素技术结合其它标记技术++++金标免疫技术检测金颗粒沉淀++++凝集反应直接凝集试验用裸眼、放大镜或显+间接凝集试验微镜观察红细胞或胶++凝集抑制试验乳等颗粒和各种凝集+++协同凝集试验现象+++抗球蛋白试验+++中和反应病毒中和试验病毒感染性丧失+毒素中和试验外毒素毒性丢失++