毛细管电泳综述论文

复杂体系分离技术毛细管电泳陈欣10132130115页1毛细管电泳摘要：毛细管电泳是新型液相分离分析技术，具有高效、快速、灵敏、试剂和样品用量少等特点。在介绍毛细管电泳分析分离基本原理的基础上，阐述了毛细管电泳的分离形式及应用范围，侧重举例阐述它在医学、化学、食品中的应用，结合目前发展情况谈谈毛细管电泳在21世纪未来的发展趋势。关键词：毛细管电泳、基本原理、分离形式、应用范围、应用实例、发展趋势Abstract:capillaryelectrophoresisisanewtypeofliquidphaseseparationanalysistechnology，withhighefficiency，rapid，sensitiveandlowdosageofreagentandsample.Intointroducethebasicprincipleofseparationofcapillaryelectrophoresisanalysis，onthebasisofcapillaryelectrophoresisseparationofformandapplicationrangeareexpounded，focusingontheexampleinthispaper，theitapplicationinthemedical，chemical，food，combiningthedevelopmentsituationaboutthetrendofthedevelopmentofcapillaryelectrophoresisinthe21stcentury.Keywords:capillaryelectrophoresisseparation，basicprinciple，form，applicationscope，applicationexamples，thedevelopmenttrend一、概述毛细管电泳，又叫高效毛细管电泳（HPCE），是八十年代问世的一种高效的液相分离方法，是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物，它已成为分析化学新兴的一个分支学科。毛细管电泳有六种不同的分离形式可供选择，所以应用广泛。同时毛细管电泳具有分析时间短，分离效率高等特点，柱效常常可达105-106理论塔极数/米。毛细管电泳的另一个显著优点是很低的样品需求量，每次进样的体积仅为1mL10nL。所有这些特点使得毛细管电泳迅速发展为一种极为有效的分离技术，广泛用于分离多种化合物，如氨基酸、糖类、维生素、杀虫剂、表面活性剂、神经递质、DNA片段等。因此，近年来，毛细管电泳在食品分析、环境分析、药物分析和生命科学等领域得到了越来越广泛的应用。二、毛细管电泳基本原理毛细管电泳是以高压电场为源动力，以毛细管为载体，依据样品中各组分之复杂体系分离技术毛细管电泳陈欣10132130115页2间迁移速度的差异和分配行为的不同而实现分离的一类液相分离分析技术。分析分离装置主要包括高压电源及其回路系统、毛细管柱系统、检测器系统（可为柱上检测或者与其他检测技术联用）和进样系统。在电解质缓冲溶液中，通过一定的方法带上电荷样品粒子在高压电场作用下，以不同的速度随电渗流迁移，先后到达检测器被检测。CE所用的石英毛细管柱在内充液PH＞3时，其表面硅羟基解离成-SiO2-，使内壁带上负电荷，和溶液作用形成双电层。在高电压电场作用下，双电层中溶剂化的水合阳离子层引起柱中溶液在毛细管内整体向负极移动，形成电渗液。然后带电粒子在毛细管内电解质溶液中的迁移速度等于电泳速度和电渗流二者的矢量之和。假如毛细管两端加的是带正向电压，则正电荷粒子最先流出，中性粒子的电泳速度相当于电渗流速度；带负电荷粒子运动方向与EOF方向相反，但EOF速度一般大于电泳速度，故其最终会在中性粒子之后流出，从而实现各种粒子的分离[1]。电渗是CE中推动流体前进的驱动力，它使整个流体像一个塞子一样以均匀的速度向前运动，使整个流型呈近似扁平型的“塞式流”。它使溶质区带在毛细管内原则上不会扩张。但在HPLC中，采用的压力驱动方式使柱中流体呈抛物线型，其中心处速度是平均速度的两倍(见图2b)，导致溶质区带本身扩张，引起柱效下降，使其分离效率不如CE。复杂体系分离技术毛细管电泳陈欣10132130115页3三、毛细管电泳分离形式[2]根据试样性质不同，采用不同的分离类型，每种机理的选择性不同。1、毛细管区带电泳（CZE）CZE是使用裸毛细管和真溶液性质的电解质缓冲溶液进行的毛细管电泳技术，是毛细管电泳中应用最广泛、最基本的一种分离模式。CZE分离机理是基于各被分离组分的荷质比之间的差异。带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。在电场力作用下，分离物质在背景缓冲溶液中因迁移速度的差异而分离，除了溶质组分的结构特点和背景缓冲溶液组成外，不复杂体系分离技术毛细管电泳陈欣10132130115页4通过其他因素对分离条件的影响。通常把CZE看成其他各种毛细管电泳分离模式的母体。应用范围包括氨基酸、多肽、蛋白质、离子、对映体拆分和很多其他本身能带电或在一定条件下能带上电荷物质的分离。2、毛细管凝胶电泳（CGE）CGE是以凝胶或高浓度线性高分子溶液为介质填充在毛细管内而进行的电泳。被分析组分因电泳而迁移，在迁移过程中依据分子的大小在起“分子筛”作用的凝胶中得以分离。将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。它的特点是抗对流性好，散热性好，分离度极高。因为蛋白质、DNA等的电荷/质量比与分子大小无关，CZE模式很难分离，采用CGE能获得良好分离，所以是DAN排序的重要手段。3、胶束电动毛细管色谱（MEKC）[3]MEKC采用临界胶束浓度以上的表面活性剂在运行缓冲液内形成疏水内核、外部带负电的动态胶束假固相，利用溶质的疏水性差异，在溶液和胶束假固相间分配的差异进行分离。该方法不仅能分离中性溶质，而且能分离带电组分，拓展了毛细管电泳技术的应用范围。毛细管电泳技术现广泛用于小分子、中性物质、手性对映体及药物等的分析分离。它是色谱与电泳分离模式的结合。4、毛细管等电聚焦（CIEF）CIEF是指依据两性化合物等电点的差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术，当施加直流电压时，在毛细管内将建立起由阳极到阴极逐步升高的pH梯复杂体系分离技术毛细管电泳陈欣10132130115页5度，具有不同等电点的物质在电场作用下迁移到等电点的pH位置，聚集形成窄的聚焦区带，使各种组分达到分离。CIEF已成功用于测定蛋白质的等电点，分离异构体等。如分别用CZE和CIEF研究制备过程中糖蛋白不同糖基化程度引起的非均一性，结果表明，CIEF方法要比CZE的效果好。5、毛细管等速电泳（CITF）CITF是一种“移动界面”电泳技术，采用两种淌度差别很大的缓冲液分别作为先导电解质（充满毛细管）和尾随电解质（置于一端的电解槽中），使被分离物质按其电泳淌度不同并位于两者之间，以同一速度移动，在先导离子和尾随离子之间形成区带，从而得以分离。该模式的特点是界面明显，有富集、浓缩作用。该方法目前常用作柱前浓缩方法用以富集样品，以提高毛细管电泳的灵敏度，降低检出限，可用于紫外吸收弱的样品组分的分离。6、毛细管电色谱（CEC）模式在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定液，以电渗流为流动相，试样组分在两相间的分配为分离机理的电动色谱过程；CEC是将高效液相色谱的固定相填充到毛细管中或在毛细管内壁涂布固定相，以电渗流为流动相驱动力的色谱过程。该模式兼具电泳和液相色谱的分离机制。它具有毛细管电泳与液相色谱的优点。下表有助于根据样品的物化性质选择合适的电泳模式。复杂体系分离技术毛细管电泳陈欣10132130115页6四、毛细管电泳的应用1、毛细管电泳在医学方面应用CE对药物及其制剂的成分分析，主要用于新药研究和开发、药品生产过程中的质量控制、药物制剂分析等。(1)化学药剂及其制剂常规分析方法能基本解决定性定量和纯度控制，但某些结构特异、性质特殊的品种仍有一定困难。CE技术恰能解决某些分析手段的不足，相关应用报道越来越多。如封宇飞等[4]采用毛细管区带电泳法，以0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH=6.0)，运行电压18kV(运行电流70～80μA)，进样时间10s，检测波长214nm，以甲氧苄氨嘧啶为内标，快速测定氯霉素滴眼液中氯霉素与二醇物的含量，用于药品生产过程中的质量控制;孙国样等[5]用高效毛细管标准加入对比法,紫外检测波长246nm，灵敏度0.010AUFS，电压12kV，背景电解质(BGE)50mmol/L硼砂溶液，重力进样10s,对复方降压片中5组分进行了定量测定，解决了由于处方组成复杂分析方法不理想的问题;在应用于新药研制过程中CE法亦极为成功，如范国荣等[6]用CZE分离模式，选择甲基麻黄素为内标,在210nm处成功地对抗疟疾新药三氟乙酰伯氨喹及其合成前体伯氨喹进行了定性定量检测，为药物合成过程中产品质量控制提供更简便、快速的检测手段。（2）中药及中药制剂[7]毛细管电泳法在中药及中药制剂方面的运用亦有相关报道。中药有效成分更为复杂，不同中药品种的活性成分含量相差悬殊，复方制剂尤甚。CE法为中药分析提供一种新的方法，目前已能对中药中主要有效成分如生物碱、有机酸类、黄酮类、香豆素类及各种苦类进行相关分析。已分析研究过的中药材有麻黄、黄复杂体系分离技术毛细管电泳陈欣10132130115页7连、黄柏、黄芩、芍药、大黄、甘草、柴胡、厚朴、当归、马钱子、丹参、吴茱萸和淫羊霍等。可用于中药材的鉴别和标难品纯度检查，特别是HPCE在指纹图谱鉴别天然药物的研究进展非常迅速,将提高中药的质量标准水平,逐步实现中药材、中成药质量标准的现代化。CE用于中药制剂方面，作为其质量控制方法，可更好促进其规范化生产，如魏惠珍等[8]用0.2mol/LTris-40mmol/L磷酸二氢钠(磷酸调节pH5.30)-40%异丙醇为缓冲液、分离电压29kV、检测波长200nm、压力进样2s、温度25℃的电泳条件，建立了一种用CE测定元胡止痛片和元胡止痛口服液中延胡索乙素含量的方法，可用作质量控制方法。(3)手性药物的分离手性药物对映体的分离在药物控制、对映体的生物活性和药理作用研究等方面有非常重要的意义。胡兵等[9]用HPCE法，以30mmol/L磷酸盐缓冲液(pH=6.5，含4%羟丙基-β-环糊精)为电泳液，检测波长248nm，运行电压10kV，操作温度25℃，压力进样1000Pa3s，快速准确测定罗格列酮钠中2种异构体的含量，可用于其手性分离的方法;张锴等[10]采用环糊精毛细管区带电泳法分离6种药物对映体，用高硫酸盐环糊精作手性分离剂，很好地拆分了美沙酮、氯口比格雷、美西律、异丙肾上腺素、苯海索和地佐辛6种临床常用的碱性药物。(4)毛细管电泳用于DNA分析CZE和MECC通常用来分离碱基、核苷、核苷酸、简单的寡核苷酸等。CGE则可用于寡核苷酸(10mers)、ssDNA和dsDNA等的分离。人类基因组计划所需解决的关键问题之一就是提高测序的速度。用CE测DNA序列的报道很多，如用短寡核苷酸引物库测DNA序列、高速DNA序列、毛细管阵列、毛细板阵列等等。对DNA分析是CE的应用重点之一，CE-MS联用也已用于DNA分析。2、毛细管电泳在化学方面应用（1）毛细管电泳法测定电离平衡常数[11]离解常数的测定方法有电势滴定法、紫外可见分光光度法和毛细管电泳法（CE）等，其中CE法被认为是一种测定pKa的十分方便而有效的方法。近些年，CE已经广泛地用于测定一级电离平衡常数。复杂体系分离技术毛细管电泳陈欣10132130115页8由二元酸H2A的平衡常数表示式、溶质有效淌度表达（）及分布系数α表示式可导出如下方程：式中μHA-和μA2-分别是HA-和A2-的绝对电泳淌度。[H+]’为一级校正氢离子活度,［H+］为二级校正氢离子活度，其分别定义为：I为离子强度,a为离子水合直径（假定为5埃）,Z为离子化